Az Alzheimer-kórban (AD) hiányoznak a fehérje biomarkerek, amelyek tükrözik annak többszörös patofiziológiáját, ami hátráltatja a diagnózis és a kezelés előrehaladását. Itt átfogó proteomikát alkalmazunk a cerebrospinális folyadék (CSF) biomarkereinek azonosítására, amelyek az AD patofiziológiájának széles skáláját képviselik. A multiplex tömegspektrometria körülbelül 3500 és körülbelül 12 000 fehérjét azonosított az AD CSF-ben, illetve az agyban. Az agyi proteom hálózati elemzése 44 biodiverzitási modult oldott fel, amelyek közül 15 átfedésben volt a cerebrospinális folyadék proteomjával. A CSF AD markerek ezekben az átfedő modulokban öt fehérjecsoportba vannak hajtogatva, amelyek különböző patofiziológiai folyamatokat képviselnek. Az AD agyban a szinapszisok és metabolitok csökkennek, de a CSF növekszik, míg az agyban és a CSF-ben a glia-gazdag mielinizáció és az immuncsoportok növekednek. A panelelváltozások konzisztenciáját és betegségspecifitását több mint 500 további CSF-minta igazolta. Ezek a csoportok biológiai alcsoportokat is azonosítottak a tünetmentes AD-ben. Összességében ezek az eredmények ígéretes lépést jelentenek a webalapú biomarker eszközök felé az AD klinikai alkalmazásaihoz.
Az Alzheimer-kór (AD) a neurodegeneratív demencia leggyakoribb oka világszerte, és számos biológiai rendszerzavar jellemzi, beleértve a szinaptikus átvitelt, a glia által közvetített immunitást és a mitokondriális metabolizmust (1-3). Mindazonáltal kialakult fehérje biomarkerei továbbra is az amiloid és tau fehérjék kimutatására összpontosítanak, és ezért nem tükrözik ezt a változatos patofiziológiát. Ezek a „mag” fehérje biomarkerek, amelyeket a legmegbízhatóbban a cerebrospinális folyadékban (CSF) mérnek, a következők: (i) amiloid béta peptid 1-42 (Aβ1-42), amely a kortikális amiloid plakkok képződését tükrözi; (ii) teljes tau, az axon degeneráció jele; (iii) foszfo-tau (p-tau), a kóros tau-hiperfoszforiláció képviselője (4-7). Bár ezek az agy-gerincvelői folyadék biomarkerek nagymértékben megkönnyítették a „markáns” AD fehérjebetegségek kimutatását (4-7), a betegség mögött meghúzódó komplex biológiának csak egy kis részét képviselik.
Az AD biomarkerek patofiziológiai diverzitásának hiánya számos kihíváshoz vezetett, beleértve (i) az AD-betegek biológiai heterogenitásának azonosításának és számszerűsítésének képtelenségét, (ii) a betegség súlyosságának és progressziójának elégtelen mérését, különösen a preklinikai stádiumban. iii) olyan terápiás gyógyszerek kifejlesztése, amelyek nem oldották meg teljesen a neurológiai állapotromlás minden aspektusát. Ha a mérföldkőnek számító patológiára hagyatkozunk a kapcsolódó betegségekből származó AD leírásában, csak súlyosbítja ezeket a problémákat. Egyre több bizonyíték bizonyítja, hogy a legtöbb idős demenciában szenvedő embernek több kóros jellemzője is van a kognitív hanyatlással kapcsolatban (8). Az AD patológiában szenvedő egyének legalább 90%-a érbetegségben, TDP-43 zárványban vagy más degeneratív betegségben is szenved (9). A kóros átfedések nagy aránya megbontotta a demencia jelenlegi diagnosztikai keretét, ezért a betegség átfogóbb patofiziológiai meghatározására van szükség.
Tekintettel arra, hogy sürgősen szükség van különféle AD biomarkerekre, a terület egyre inkább alkalmazza az „omics” módszert, amely a biomarkerek felfedezésének átfogó rendszerén alapul. Az Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance 2014-ben indult, és a program élén áll. Az Országos Egészségügyi Intézetek, a tudományos körök és az ipar ezen multidiszciplináris erőfeszítése rendszeralapú stratégiák alkalmazása az AD patofiziológiájának pontosabb meghatározására, valamint a biodiverzitás-diagnosztikai elemzési és kezelési stratégiák kidolgozására (10). A projekt részeként a hálózati proteomika ígéretes eszközzé vált a rendszeralapú biomarkerek fejlesztésében az AD-ben. Ez az elfogulatlan adatvezérelt megközelítés összetett proteomikai adatkészleteket szervez együtt expresszált fehérjék csoportjaiba vagy „moduljaiba”, amelyek meghatározott sejttípusokhoz, organellumokhoz és biológiai funkciókhoz kapcsolódnak (11-13). Csaknem 12 információban gazdag hálózati proteomikai vizsgálatot végeztek az AD agyon (13-23). Összességében ezek az elemzések azt mutatják, hogy az AD agyhálózati proteomja erősen konzervált moduláris szervezetet tart fenn független kohorszokban és több kérgi régióban. Ezen túlmenően ezen modulok némelyike reprodukálható változásokat mutat az AD-vel kapcsolatos bőségben az adatkészletek között, tükrözve több betegség patofiziológiáját. Összességében ezek az eredmények ígéretes horgonypontot mutatnak az agyhálózati proteom felfedezésében, mint rendszeralapú biomarkerben az AD-ben.
Annak érdekében, hogy az AD agyhálózati proteomját klinikailag hasznos, rendszeralapú biomarkerekké alakítsuk, az agyból származó hálózatot kombináltuk az AD CSF proteomikai elemzésével. Ez az integrált megközelítés öt ígéretes CSF biomarker készlet azonosításához vezetett, amelyek az agy alapú patofiziológiájának széles skálájához kapcsolódnak, beleértve a szinapszisokat, az ereket, a mielinizációt, a gyulladást és az anyagcsere-utak diszfunkcióját. Sikeresen validáltuk ezeket a biomarker paneleket többszörös replikációs elemzéssel, beleértve a különböző neurodegeneratív betegségekből származó több mint 500 CSF-mintát. Ezek a validációs elemzések magukban foglalják a tünetmentes AD-ben (AsymAD) szenvedő betegek CSF-jében lévő csoportcélpontok vizsgálatát, vagy normál kognitív környezetben abnormális amiloid-felhalmozódásra utaló jeleket. Ezek az elemzések rávilágítanak az AsymAD populáció jelentős biológiai heterogenitására, és azonosítják a panel markereket, amelyek alkalmasak lehetnek az egyének altípusára a betegség legkorábbi stádiumában. Összességében ezek az eredmények kulcsfontosságú lépést jelentenek a több rendszeren alapuló fehérje biomarker eszközök kifejlesztésében, amelyek sikeresen megoldják az AD számos klinikai kihívását.
Ennek a tanulmánynak a fő célja olyan új liquor biomarkerek azonosítása, amelyek tükrözik a különböző agyi alapú patofiziológiákat, amelyek AD-hez vezetnek. Az S1 ábra felvázolja kutatási módszertanunkat, amely magában foglalja (i) az AD CSF és a hálózati agyi proteom előzetes eredményein alapuló átfogó elemzést az agyhoz kapcsolódó CSF-betegség több biomarkerének azonosítására, és (ii) a későbbi replikációt. Ezek a biomarkerek több független cerebrospinalisban találhatók. folyékony kohorszok. A felfedezés-orientált kutatás a CSF differenciális expressziójának elemzésével kezdődött 20 kognitívlag normális egyénben és 20 AD-betegben az Emory Goizueta Alzheimer-kór kutatóközpontjában (ADRC). Az AD diagnózisát jelentős kognitív károsodásként határozzák meg alacsony Aβ1-42 és emelkedett össz-tau és p-tau jelenlétében az agy-gerincvelői folyadékban [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (S1A táblázat). A kontroll (átlag MoCA, 26,7 ± 2,2) normális CSF biomarkerekkel rendelkezett.
A humán CSF-et a fehérjebőség dinamikus tartománya jellemzi, amelyben az albumin és más rendkívül bőséges fehérjék megakadályozhatják az érdeklődésre számot tartó fehérjék kimutatását (24). A fehérjefelfedezés mélységének növelése érdekében minden egyes CSF-mintából eltávolítottuk az első 14 nagy mennyiségben előforduló fehérjét a tömegspektrometriás (MS) elemzés előtt (24). Az MS összesen 39 805 peptidet azonosított, amelyeket 40 mintában 3691 proteomra térképeztek fel. A fehérje mennyiségi meghatározását többszörös tandem tömegcímkével (TMT) végezzük (18, 25). A hiányzó adatok feloldása érdekében csak azokat a fehérjéket vontuk be, amelyek a minták legalább 50%-ában voltak számszerűsítve a későbbi elemzésben, így végül 2875 proteomot határoztunk meg. A teljes fehérjebőség szintjei közötti szignifikáns különbség miatt a kontroll mintát statisztikailag kiugrónak tekintettük (13), és nem vettük bele a későbbi elemzésbe. A fennmaradó 39 minta abundancia-értékeit kor, nem és tétel kovariancia szerint korrigáltuk (13-15, 17, 18, 20, 26).
Statisztikai t-teszt elemzést használva a regressziós adatkészlet differenciált expressziójának értékelésére, ez az elemzés azonosította azokat a fehérjéket, amelyek bőségszintje szignifikánsan megváltozott (P <0,05) a kontroll és az AD esetek között (S2A táblázat). Amint az 1A. ábrán látható, az AD-ben összesen 225 fehérje mennyisége szignifikánsan csökkent, és 303 fehérje mennyisége jelentősen megnőtt. Ezek a differenciálisan expresszálódó fehérjék számos korábban azonosított liquor AD markert tartalmaznak, mint például a mikrotubulusokhoz kapcsolódó protein tau (MAPT; P = 3,52 × 10-8), a neurofilamentum (NEFL; P = 6,56 × 10-3), a növekedéssel kapcsolatos protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10–5), zsírsavkötő fehérje 3 (FABP3; P = 2,00 × 10–5), kitináz 3 hasonló 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10–6), idegi granulátum (NRGN; P = 3,43 × 10-4) és a VGF idegnövekedési faktor (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Ugyanakkor más nagyon fontos célpontokat is azonosítottunk, mint például a GDP disszociáció gátló 1-et (GDI1; P = 1,54 × 10-10) és a SPARC-hoz kapcsolódó moduláris kalciumkötődést 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). 225 szignifikánsan csökkent fehérje génontológiai (GO) analízise szoros összefüggést mutatott ki a testfolyadék folyamataival, például a szteroid anyagcserével, a véralvadással és a hormontevékenységgel (1B ábra és S2B táblázat). Ezzel szemben a szignifikánsan megnövekedett 303 fehérje szorosan összefügg a sejtszerkezettel és az energiaanyagcserével.
(A) A vulkán diagram a log2-szeres változást (x-tengely) mutatja a t-próbával kapott -log10 statisztikai P-értékhez (y-tengely) viszonyítva, amelyet a kontroll (CT) és a kontroll (CT) és a különbségi expresszió kimutatására használnak. Az összes fehérje CSF-proteomjának AD esetei. Az AD-ban szignifikánsan csökkent szintû (P <0,05) fehérjék kék színnel, míg a betegségben szignifikánsan megnövekedett szintû fehérjék piros színnel jelennek meg. A kiválasztott fehérje jelölve van. (B) A fehérjével kapcsolatos legfontosabb GO kifejezések szignifikánsan csökkentek (kék) és növekedtek (piros) AD-ben. A biológiai folyamatok, a molekuláris funkciók és a sejtkomponensek területén a legmagasabb z-pontszámmal rendelkező három GO kifejezést mutatja. (C) Az MS mérte a MAPT szintet a CSF-mintában (balra), és ennek korrelációját a minta ELISA tau-szintjével (jobbra). Megjelenik a Pearson korrelációs együttható a megfelelő P értékkel. Egy AD-esetre vonatkozó ELISA-adatok hiánya miatt ezek a számok a 39 elemzett esetből 38 értéket tartalmaznak. (D) Felügyelt klaszteranalízis (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) korrigált P <0,01) a kontrollon és az AD CSF-en talált mintákat az adathalmaz 65 legszignifikánsabban megváltozott fehérjével. Normalizálni, normalizálni.
A MAPT proteomikus szintje szorosan összefügg a függetlenül mért ELISA tau szinttel (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; 1C. ábra), ami alátámasztja MS mérésünk érvényességét. Az amiloid prekurzor fehérje (APP) szintjén végzett tripszin emésztés után az Aβ1-40 és az Aβ1-42 C-terminálisához leképezett izoforma-specifikus peptidek nem ionizálhatók hatékonyan (27, 28). Ezért az általunk azonosított APP peptideknek semmi közük az ELISA Aβ1-42 szintekhez. Az egyes esetek differenciális expressziójának értékelése érdekében a minták felügyelt klaszteranalízisének elvégzéséhez differenciálisan expresszált fehérjéket használtunk, amelyek P <0,0001 [hamis felfedezési arány (FDR) korrigált P <0,01] (S2A táblázat). Amint az 1D. ábrán látható, ez a 65 rendkívül szignifikáns fehérje megfelelően csoportosíthatja a mintákat a betegség állapotának megfelelően, kivéve egy kontroll-szerű jellemzőkkel rendelkező AD esetet. Ebből a 65 fehérjéből 63 nőtt AD-ben, míg csak kettő (CD74 és ISLR) csökkent. Összességében ezek a cerebrospinális folyadékelemzések több száz fehérjét azonosítottak az AD-ben, amelyek betegségek biomarkereként szolgálhatnak.
Ezután független hálózati elemzést végeztünk az AD agyi proteomján. Ennek a felfedezésnek az agyi kohorszába tartozott a kontrollból származó dorzolaterális prefrontális kéreg (DLPFC), a Parkinson-kór (PD; n = 10), a vegyes AD/PD (n = 10) és az AD (n = 10) esetei. ) Minta. Emery Goizueta ADRC. Ennek a 40 esetnek a demográfiai adatait korábban leírtuk (25), és az S1B táblázatban foglaltuk össze. Ennek a 40 agyszövetnek és a 27 esetből álló replikációs kohorsznak a vizsgálatához TMT-MS-t használtunk. Összességében ez a két agyi adatkészlet 227 121 egyedi peptidet termelt, amelyeket 12 943 proteomhoz rendeltek (25). Csak azokat a fehérjéket vonták be a későbbi vizsgálatokba, amelyeket az esetek legalább 50%-ában mennyiségileg meghatároztak. A végső felfedezési adatkészlet 8817 mennyiségileg meghatározott fehérjét tartalmaz. Állítsa be a fehérje bőség szintjét az életkor, a nem és a post mortem intervallum (PMI) alapján. Az adatok regresszió utáni differenciális expressziós elemzése azt mutatta, hogy több mint 2000 fehérjeszint szignifikánsan megváltozott [P <0,05, varianciaanalízis (ANOVA)] két vagy több betegség kohorszban. Ezután felügyelt klaszteranalízist végeztünk a differenciálisan expresszált fehérjék és P <0,0001 alapján AD/kontroll és/vagy AD/PD összehasonlításban (S2, A és B ábra, S2C táblázat). Ez a 165 erősen megváltozott fehérje egyértelműen ábrázolja az AD patológiás eseteket a kontroll és a PD mintákból, megerősítve az erős AD-specifikus változásokat a teljes proteomban.
Ezután a Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) nevű algoritmus segítségével hálózati elemzést végeztünk a felfedezett agyi proteomon, amely az adathalmazt hasonló expressziós mintázatú fehérjemodulokba rendezi (11-13). Az elemzés 44 modulban (M) együtt expresszált fehérjét azonosított, a legnagyobbtól (M1, n = 1821 fehérje) a legkisebbig (M44, n = 34 fehérje) válogatva és számozva (2A ábra és S2D táblázat). Ahogy fentebb említettük (13) Számítsa ki az egyes modulok reprezentatív expressziós profilját vagy jellemző fehérjét, és korrelálja azt a betegség állapotával és az AD patológiával, azaz hozza létre az Alzheimer-kór regisztere (CERAD) és a Braak Score szövetségét (2B. ábra). Összességében 17 modul kapcsolódott szignifikánsan az AD neuropatológiához (P <0,05). Ezen betegségekhez kapcsolódó modulok közül sok gazdag sejttípus-specifikus markerekben (2B. ábra). Amint fentebb említettük (13), a sejttípus-dúsítást a modul átfedésének és a sejttípus-specifikus gének referencialistájának elemzésével határozzuk meg. Ezek a gének izolált egér neuronokban, endothel- és gliasejtekben publikált adatokból származnak. RNS-szekvenálási (RNA-seq) kísérlet (29).
(A) Fedezze fel az agyi proteom WGCNA-ját. (B) A moduláris aláírás fehérje (a moduláris fehérje expresszió első fő komponense) kétsúlyú középkorrelációs (BiCor) elemzése AD neuropatológiai jellemzőkkel (fent), beleértve a CERAD (Aβ plakk) és Braak (tau gubancok) pontszámokat. A pozitív (piros) és negatív (kék) korrelációk intenzitását kétszínű hőtérkép mutatja, a csillagok pedig a statisztikai szignifikanciát jelzik (P <0,05). Használja a Hypergeometric Fisher-féle pontos tesztet (FET) (alul) az egyes fehérjemodulok sejttípus-asszociációjának felméréséhez. A piros árnyékolás intenzitása a sejttípus-dúsulás mértékét, a csillag pedig a statisztikai szignifikanciát jelzi (P <0,05). Használja a BH módszert a FET-ből származó P érték korrigálására. (C) Moduláris fehérjék GO elemzése. Az egyes modulokhoz vagy kapcsolódó modulcsoportokhoz a legszorosabban kapcsolódó biológiai folyamatok láthatók. oligo, oligodendrocita.
Öt, egymással szorosan összefüggő asztrocita és mikroglia-gazdag modul (M30, M29, M18, M24 és M5) sorozata erős pozitív korrelációt mutatott az AD neuropatológiájával (2B. ábra). Az ontológiai elemzés összekapcsolja ezeket a gliamodulokat a sejtnövekedéssel, proliferációval és immunitással (2C ábra és S2E táblázat). Két további gliamodul, az M8 és az M22 szintén erősen szabályozott betegségben. Az M8 szorosan kapcsolódik a Toll-szerű receptor útvonalhoz, egy jelátviteli kaszkádhoz, amely kulcsszerepet játszik a veleszületett immunválaszban (30). Ugyanakkor az M22 szorosan kapcsolódik a poszttranszlációs módosításhoz. Az oligodendrocitákban gazdag M2 erős pozitív korrelációt mutat az AD patológiával, valamint ontológiai kapcsolatot a nukleozidszintézissel és a DNS-replikációval, ami betegségekben fokozott sejtproliferációt jelez. Összességében ezek az eredmények alátámasztják a gliamodulok emelkedését, amelyet korábban megfigyeltünk az AD hálózati proteomban (13, 17). Jelenleg azt találták, hogy a hálózatban sok AD-vel kapcsolatos gliamodul alacsonyabb expressziós szintet mutat a kontroll és a PD esetekben, kiemelve a betegségspecifikusságukat, amely AD-ban megemelkedett (S2C ábra).
Hálózati proteomunkban csak négy modul (M1, M3, M10 és M32) van erősen negatív korrelációban az AD patológiával (P <0,05) (2. ábra, B és C). Mind az M1, mind az M3 gazdag neuronális markerekben. Az M1 szorosan összefügg a szinaptikus jelekkel, míg az M3 a mitokondriális funkcióval. Nincs bizonyíték az M10 és M32 sejttípus-dúsítására. Az M32 az M3 és a sejtmetabolizmus közötti kapcsolatot tükrözi, míg az M10 szorosan összefügg a sejtnövekedéssel és a mikrotubulusok működésével. Az AD-hez képest mind a négy modul megnövekedett a kontrollban és a PD-ben, ami betegség-specifikus AD-változásokat eredményez (S2C ábra). Összességében ezek az eredmények alátámasztják a neuronokban gazdag modulok csökkenését, amelyet korábban megfigyeltünk az AD-ben (13, 17). Összefoglalva, az általunk felfedezett agyi proteom hálózati elemzése AD-specifikusan módosított modulokat hozott létre, amelyek összhangban vannak korábbi eredményeinkkel.
Az AD-t korai tünetmentes stádium (AsymAD) jellemzi, amelyben az egyének amiloid felhalmozódást mutatnak klinikai kognitív hanyatlás nélkül (5, 31). Ez a tünetmentes szakasz a korai felismerés és beavatkozás kritikus ablaka. Korábban kimutattuk az AsymAD és az AD agyhálózati proteom erős moduláris megőrzését független adatkészleteken keresztül (13, 17). Annak biztosítása érdekében, hogy a jelenleg felfedezett agyi hálózat összhangban legyen ezekkel a korábbi eredményekkel, 44 modul megőrzését elemeztük a 27 DLPFC-szervezet replikált adatkészletében. Ezek a szervezetek magukban foglalják a kontroll (n = 10), AsymAD (n = 8) és AD (n = 9) eseteket. A kontroll és az AD mintákat bevontuk felfedező agyi kohorszunk elemzésébe (S1B táblázat), míg az AsymAD esetek csak a replikációs kohorszban voltak egyedülállóak. Ezek az AsymAD esetek is az Emory Goizueta ADRC agybankból származtak. Bár a kogníció normális volt a halál időpontjában, az amiloidszint abnormálisan magas volt (átlagos CERAD, 2,8 ± 0,5) (S1B táblázat).
A 27 agyszövet TMT-MS analízise 11 244 proteom mennyiségi meghatározását eredményezte. Ez a végső szám csak azokat a fehérjéket tartalmazza, amelyek mennyiségileg a minták legalább 50%-ában megtalálhatók. Ez a replikált adatkészlet 8638-at (98,0%) tartalmaz a felfedezett agyi elemzésünk során kimutatott 8817 fehérjéből, és közel 3000 fehérjét tartalmaz szignifikánsan a kontroll és az AD kohorsz között (P <0,05, Tukey páros t-tesztje után a varianciaanalízishez) S2F táblázat). Ezen eltérően expresszálódó fehérjék közül a 910 szintén szignifikáns szintváltozást mutatott az AD és az agyi proteom kontroll esetei között (P <0,05, ANOVA Tukey páros t-teszt után). Érdemes megjegyezni, hogy ezek a 910-es markerek nagyon konzisztensek a proteomok közötti változás irányában (r = 0, 94, P <1, 0 × 10-200) (S3A ábra). A megnövekedett fehérjék közül az adatsorok között a legkonzisztensebb változást mutató fehérjék főként a gliában gazdag M5 és M18 modulok (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 és GFAP) tagjai. A redukált fehérjék közül a legkonzisztensebb változásokat mutatók szinte kizárólag a szinapszishoz kapcsolódó M1 modul (NPTX2, VGF és RPH3A) tagjai voltak. A midkine (MDK), a CD44, a szekretált frizzled-kapcsolódó protein 1 (SFRP1) és a VGF AD-vel összefüggő változásait Western blottal igazoltuk (S3B ábra). A modul megőrzési elemzése azt mutatta, hogy az agy proteomjában lévő fehérjemodulok körülbelül 80%-a (34/44) szignifikánsan konzervált volt a replikációs adatkészletben (z-score> 1,96, FDR korrigált P <0,05) (S3C ábra). E modulok közül tizennégyet kifejezetten a két proteom között foglaltak le (z-score> 10, FDR korrigált P <1,0 × 10-23). Összességében az agyi proteomok közötti differenciális expresszió és moduláris összetétel nagyfokú konzisztenciájának felfedezése és replikációja rávilágít az AD frontális kéregfehérjékben bekövetkezett változások reprodukálhatóságára. Ezenkívül azt is megerősítette, hogy az AsymAD és a fejlettebb betegségek nagyon hasonló agyhálózati struktúrával rendelkeznek.
Az agyi replikációs adatkészlet differenciális expressziójának részletesebb elemzése rávilágít az AsymAD fehérje változásának jelentős mértékűre, beleértve összesen 151 szignifikánsan megváltozott fehérjét az AsymAD és a kontroll között (P <0,05) (S3D ábra). Az amiloid terhelésnek megfelelően az APP az AsymAD és az AD agyában jelentősen megnőtt. A MAPT csak az AD-ben változik szignifikánsan, ami összhangban van a gubancok megnövekedett szintjével és annak ismert korrelációjával a kognitív hanyatlással (5, 7). A gliában gazdag modulok (M5 és M18) nagymértékben tükröződnek az AsymAD megnövekedett fehérjéjében, míg a neuronokhoz kapcsolódó M1 modul a leginkább reprezentatív az AsymAD csökkent fehérjék közül. Ezen AsymAD markerek közül sok nagyobb változásokat mutat a tünetekkel járó betegségekben. E markerek közé tartozik a SMOC1, az M18-hoz tartozó gliafehérje, amely az agydaganatokhoz, valamint a szemek és a végtagok fejlődéséhez kapcsolódik (32). Az MDK egy heparinkötő növekedési faktor, amely a sejtnövekedéshez és az angiogenezishez kapcsolódik (33), az M18 másik tagja. A kontrollcsoporthoz képest az AsymAD szignifikánsan növekedett, amit az AD nagyobb növekedése követett. Ezzel szemben a neuropentraxin 2 (NPTX2) szinaptikus fehérje szignifikánsan csökkent az AsymAD agyban. Az NPTX2-t korábban a neurodegenerációval társították, és elismert szerepe van a serkentő szinapszisok közvetítésében (34). Összességében ezek az eredmények számos különböző preklinikai fehérjeváltozást tárnak fel az AD-ben, amelyek úgy tűnik, hogy a betegség súlyosságával előrehaladnak.
Tekintettel arra, hogy jelentős mértékű fehérjelefedettséget értünk el az agyi proteom felfedezése során, megpróbáljuk jobban megérteni az átfedést a hálózati szintű AD-transzkriptomával. Ezért összehasonlítottuk az általunk felfedezett agyi proteomot azzal a modullal, amelyet korábban 18 204 gén microarray mérésével generáltunk AD (n = 308) és kontroll (n = 157) DLPFC szövetekben (13). átfedő. Összesen 20 különböző RNS-modult azonosítottunk, amelyek közül sok specifikus sejttípusok, köztük neuronok, oligodendrociták, asztrociták és mikroglia feldúsulását mutatta (3A. ábra). Ezeknek a moduloknak az AD-ben történő többszörös változását a 3B. ábra mutatja. A mélyebb, jelöletlen MS proteomot (körülbelül 3000 fehérjét) használó korábbi fehérje-RNS átfedés-elemzésünkkel összhangban (13) az agyi proteomhálózatban talált 44 modul többsége a transzkriptom hálózatban található. Nincs jelentős átfedés. A 34 fehérjemodul felfedezése és replikációja, amelyek erősen megmaradnak az agyi proteomban, mindössze 14 (~40%) felelt meg a Fisher-féle egzakt teszten (FET) statisztikailag szignifikáns átfedésnek bizonyult a transzkriptomával (3A. ábra). Kompatibilis a DNS-károsodás javításával (P-M25 és P-M19), a fehérje transzlációval (P-M7 és P-M20), az RNS-kötéssel/splicing-el (P-M16 és P-M21) és a fehérje célzással (P-M13 és P- M23) nem fedi át az átiratban szereplő modulokat. Ezért, bár a jelenlegi átfedés-elemzésben mélyebb proteom-adatkészletet használnak (13), az AD-hálózati proteom nagy része nincs leképezve a transzkriptom hálózathoz.
(A) A hipergeometrikus FET bemutatja a sejttípus-specifikus markerek feldúsulását az AD-transzkriptom RNS-moduljában (fent), valamint az AD-agy RNS- (x-tengely) és fehérje (y-tengely) moduljai közötti átfedés mértékét. (alul) . A piros árnyékolás intenzitása a felső panelen lévő cellatípusok dúsításának mértékét, az alsó panelen pedig a modulok átfedésének intenzitását jelzi. A csillagok statisztikai szignifikanciát jelölnek (P <0,05). (B) Az egyes transzkriptommodulok jellemző génjei és az AD állapot közötti korreláció mértéke. A bal oldali modulok korrelálnak a legnegatívabban az AD-vel (kék), a jobb oldaliak pedig a legpozitívabban az AD-vel (piros). A log-transzformált BH-korrigált P érték az egyes korrelációk statisztikai szignifikancia fokát jelzi. (C) Jelentősen átfedő modulok megosztott cellatípus-dúsítással. (D) A jelzett fehérje (x tengely) és RNS (y tengely) log2-szeres változásának korrelációs elemzése az átfedő modulban. Megjelenik a Pearson korrelációs együttható a megfelelő P értékkel. Mikro, mikroglia; égitestek, asztrociták. CT, kontroll.
A legtöbb átfedő fehérje- és RNS-modul hasonló sejttípus-dúsítási profillal és következetes AD változási irányokkal rendelkezik (3. ábra, B és C). Más szavakkal, az agyi proteom szinapszishoz kapcsolódó M1 modulja (PM1) három neuronokban gazdag homológ RNS-modulhoz (R-M1, R-M9 és R-M16) van hozzárendelve, amelyek AD-ben vannak. csökkentett szint. Hasonlóképpen, a gliában gazdag M5 és M18 fehérje modulok átfedésben vannak az asztrocitákban és mikroglia markerekben gazdag RNS modulokkal (R-M3, R-M7 és R-M10), és nagymértékben részt vesznek a betegségekben. Ezek a közös moduláris jellemzők a két adatkészlet között tovább támogatják a sejttípus-dúsulást és a betegséggel összefüggő változásokat, amelyeket az agy proteomjában figyeltünk meg. Azonban számos jelentős különbséget figyeltünk meg az egyes markerek RNS- és fehérjeszintje között ezekben a megosztott modulokban. Az átfedő modulokon belüli molekulák proteomikájának és transzkriptomikájának differenciális expressziójának korrelációs elemzése (3D. ábra) rávilágít erre az inkonzisztenciára. Például az APP és számos más gliamodul fehérje (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 és SFRP1) szignifikáns növekedést mutatott az AD proteomban, de az AD transzkriptomában szinte nem volt változás. Ezek a fehérje-specifikus változások szorosan összefügghetnek az amiloid plakkokkal (23, 35), kiemelve a proteomot, mint a kóros elváltozások forrását, és ezek a változások nem feltétlenül tükröződnek a transzkriptomban.
Az általunk felfedezett agy és CSF-proteomok független elemzése után elvégeztük a két adatkészlet átfogó elemzését, hogy azonosítsuk az agyhálózat patofiziológiájával kapcsolatos AD CSF biomarkereket. Először meg kell határoznunk a két proteom átfedését. Bár széles körben elfogadott, hogy a CSF az AD agy neurokémiai változásait tükrözi (4), az AD agy és a CSF-proteom közötti átfedés pontos mértéke nem világos. A két proteomunkban kimutatott közös géntermékek számának összehasonlításával azt találtuk, hogy a liquorban azonosított fehérjék közel 70%-a (n = 1936) az agyban is számszerűsíthető (4A ábra). Ezen átfedő fehérjék többsége (n = 1721) a felfedező agy adatkészletéből származó 44 koexpressziós modul egyikéhez van hozzárendelve (4B. ábra). Ahogy az várható volt, a hat legnagyobb agymodul (M1-M6) mutatta a legnagyobb mértékű CSF-átfedést. Vannak azonban kisebb agymodulok (például M15 és M29), amelyek váratlanul nagy átfedést érnek el, nagyobbak, mint egy kétszer akkora agymodul. Ez arra késztet bennünket, hogy egy részletesebb, statisztikailag vezérelt módszert alkalmazzunk az agy és a cerebrospinális folyadék közötti átfedés kiszámítására.
(A és B) A felfedező agyban és a CSF-ben kimutatott fehérjék átfedik egymást. Ezen átfedő fehérjék többsége az agy koexpressziós hálózatának 44 koexpressziós moduljának egyikéhez kapcsolódik. (C) Fedezze fel az átfedést a cerebrospinális folyadék proteomja és az agyhálózati proteom között. A hőtérkép minden sora a hipergeometrikus FET külön átfedő elemzését jelenti. A felső sor az agymodul és a teljes CSF proteom közötti átfedést (szürke/fekete árnyalat) ábrázolja. A második sor azt mutatja, hogy az agymodulok és a (pirossal árnyalatú) CSF-fehérje közötti átfedés szignifikánsan felszabályozott AD-ben (P <0,05). A harmadik sor azt mutatja, hogy az agymodulok és a CSF fehérje közötti átfedés (kék árnyékolás) szignifikánsan lecsökkent AD-ben (P <0,05). Használja a BH módszert a FET-ből származó P érték korrigálására. (D) Összecsukható modulpanel a cellatípus-társítás és a kapcsolódó GO kifejezések alapján. Ezek a panelek összesen 271 agyhoz kapcsolódó fehérjét tartalmaznak, amelyek jelentős különbséget mutatnak a CSF proteomjában.
Egyfarkú FET-ek segítségével felmértük a fehérje átfedésének fontosságát a CSF proteomja és az egyes agymodulok között. Az elemzés feltárta, hogy a CSF-adatkészletben összesen 14 agymodul rendelkezik statisztikailag szignifikáns átfedéssel (FDR korrigált P <0,05), és egy további modul (M18), amelynek átfedése közel van a szignifikanciához (FDR korrigált P = 0,06) (4C ábra) , felső sor). Érdekelnek bennünket azok a modulok is, amelyek erősen átfednek a differenciálisan expresszált CSF fehérjékkel. Ezért két további FET-analízist alkalmaztunk annak meghatározására, hogy az (i) CSF fehérje szignifikánsan megnövekedett AD-ben és (ii) a CSF fehérje csökkent szignifikánsan AD-ban (P <0,05, páros t teszt AD/kontroll) agymodulok jelentős átfedéssel közöttük. Amint a 4C. ábra középső és alsó sora mutatja, ezek a további elemzések azt mutatják, hogy a 44 agymodul közül 8 szignifikánsan átfedésben van az AD CSF-ben hozzáadott fehérjével (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 és M38). . ), míg csak két modul (M6 és M15) mutatott jelentős átfedést a redukált fehérjével az AD CSF-ben. Ahogy az várható volt, mind a 10 modul abban a 15 modulban van, amelyek a legnagyobb átfedésben vannak a CSF proteommal. Ezért feltételezzük, hogy ez a 15 modul az AD agyból származó CSF biomarkerek nagy hozamú forrása.
Ezt a 15 átfedő modult öt nagy fehérjepanelbe hajtogattuk a WGCNA-fadiagramban való közelségük, valamint a sejttípusokkal és a génontológiával való kapcsolatuk alapján (4D ábra). Az első panel neuronmarkerekben és szinapszisokhoz kapcsolódó fehérjékben (M1 és M12) gazdag modulokat tartalmaz. A szinaptikus panel összesen 94 fehérjét tartalmaz, és a CSF-proteom szintjei jelentősen megváltoztak, így az öt panel közül az agyhoz kapcsolódó CSF-markerek legnagyobb forrása. A második csoport (M6 és M15) szoros kapcsolatot mutatott ki az endothel sejtmarkerekkel és a vaszkuláris testtel, mint például a „sebgyógyulás” (M6) és a „humorális immunválasz szabályozása” (M15). Az M15 szintén szorosan összefügg a lipoprotein metabolizmussal, amely szorosan összefügg az endotéliummal (36). Az érpanel 34, az agyhoz kapcsolódó CSF markert tartalmaz. A harmadik csoportba azok a modulok (M2 és M4) tartoznak, amelyek szignifikánsan kapcsolódnak az oligodendrocita markerekhez és a sejtproliferációhoz. Például az M2 legfelső szintű ontológiai kifejezései közé tartozik a „DNS-replikáció pozitív szabályozása” és a „purin bioszintézis folyamata”. Eközben az M4-hez tartozik a „gliasejtek differenciálódása” és a „kromoszóma szegregáció”. A mielinizációs panel 49, az agyhoz kapcsolódó CSF markert tartalmaz.
A negyedik csoport tartalmazza a legtöbb modult (M30, M29, M18, M24 és M5), és szinte minden modul szignifikánsan gazdag mikroglia és asztrocita markerekben. A myelinizációs panelhez hasonlóan a negyedik panel is tartalmaz olyan modulokat (M30, M29 és M18), amelyek szorosan kapcsolódnak a sejtproliferációhoz. A csoport többi modulja erősen rokon az immunológiai kifejezésekkel, mint például az „immunhatás folyamata” (M5) és az „immunválasz szabályozása” (M24). A glia immuncsoport 42, az agyhoz kapcsolódó CSF markert tartalmaz. Végül az utolsó panel 52 agyhoz kapcsolódó markert tartalmaz a négy modulon (M44, M3, M33 és M38), amelyek mindegyike a testen az energiatárolással és az anyagcserével kapcsolatos. Ezen modulok közül a legnagyobb (M3) szorosan kapcsolódik a mitokondriumokhoz, és gazdag neuron-specifikus markerekben. Az M38 az egyik kisebb modultag ebben a metabolomban, és mérsékelt neuronspecifitást is mutat.
Összességében ez az öt panel az AD kéreg sejttípusainak és funkcióinak széles skáláját tükrözi, és együttesen 271 agyvel kapcsolatos CSF-markert tartalmaz (S2G táblázat). Ezen MS-eredmények érvényességének értékelésére a közelségi kiterjesztési vizsgálatot (PEA), egy ortogonális antitest-alapú technológiát alkalmaztuk, amely multiplexelési képességgel, nagy érzékenységgel és specifitással rendelkezik, és újraelemeztük az agy-gerincvelői folyadékmintákat, amelyeket találtunk. A 271 biomarker egy részhalmaza. (n=36). Ez a 36 célpont a PEA AD többszörösének változását mutatja, amely szorosan összefügg az MS-alapú megállapításainkkal (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), ami erősen igazolta átfogó MS-elemzésünk eredményeit (S4 ábra). ).
Az öt csoportunk által hangsúlyozott biológiai témák a szinaptikus jelátviteltől az energiaanyagcseréig mind az AD patogeneziséhez kapcsolódnak (1-3). Ezért mind a 15 modul, amely ezeket a paneleket tartalmazza, kapcsolódik az általunk felfedezett agyi proteomban lévő AD patológiához (2B. ábra). A legfigyelemreméltóbb a gliamoduljaink közötti magas pozitív patológiai korreláció és a legnagyobb neuronális moduljaink (M1 és M3) közötti erős negatív patológiai korreláció. A replikált agyi proteomunk differenciális expressziós elemzése (S3D ábra) szintén kiemeli az M5 és M18 eredetű gliafehérjéket. Az AsymAD-ban és a tünetekkel járó AD-ben a legtöbb megnövekedett gliafehérjék és M1-hez kapcsolódó szinapszisok A fehérje csökken a leginkább. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy az öt csoportban azonosított 271 cerebrospinális folyadék marker az AD kéreg betegségi folyamataihoz kapcsolódik, beleértve azokat is, amelyek a korai tünetmentes stádiumban fordulnak elő.
Az agyban és a gerincfolyadékban lévő panelfehérjék változási irányának jobb elemzése érdekében a 15 átfedő modul mindegyikére a következőket rajzoltuk: (i) megtaláltuk a modul bőség szintjét az agyi adatkészletben és (ii) a modult fehérje A különbség a cerebrospinális folyadékban fejeződik ki (S5. ábra). Amint azt korábban említettük, a WGCNA-t az agy modulszámának vagy jellegzetes fehérjeértékének meghatározására használják (13). A vulkántérképet a moduláris fehérjék eltérő expressziójának leírására használják a cerebrospinális folyadékban (AD/kontroll). Ezek az ábrák azt mutatják, hogy az öt panel közül három különböző expressziós trendeket mutat az agyban és a gerincfolyadékban. A szinapszis panel két modulja (M1 és M12) az AD agy abundanciaszintjének csökkenését mutatja, de szignifikánsan átfedésben van az AD CSF megnövekedett fehérjével (S5A ábra). A metabolomot tartalmazó neuronokhoz kapcsolódó modulok (M3 és M38) hasonló agyi és cerebrospinális folyadék expressziós mintázatokat mutattak, amelyek inkonzisztensek (S5E ábra). A vaszkuláris panel különböző expressziós trendeket is mutatott, bár moduljai (M6 és M15) mérsékelten növekedtek az AD agyban, és csökkentek a beteg CSF-ben (S5B ábra). A fennmaradó két panel nagy gliahálózatokat tartalmaz, amelyek fehérjéi mindkét rekeszben következetesen fel vannak szabályozva (S5, C és D ábra).
Kérjük, vegye figyelembe, hogy ezek a tendenciák nem jellemzőek az összes jelölőre ezeken a paneleken. Például a szinaptikus panel számos olyan fehérjét tartalmaz, amelyek jelentősen csökkentek az AD agyban és a CSF-ben (S5A ábra). Ezek között a lefelé szabályozott cerebrospinális folyadék markerek között szerepel az M1 NPTX2 és VGF, valamint az M12 kromogranin B. E kivételek ellenére azonban a legtöbb szinaptikus markerünk emelkedett az AD gerincfolyadékban. Összességében ezek az elemzések képesek voltak statisztikailag szignifikáns tendenciákat megkülönböztetni az agy és a cerebrospinális folyadék szintjében mind az öt panelen. Ezek a tendenciák rávilágítanak az agy és a CSF fehérje expressziója közötti összetett és gyakran eltérő kapcsolatra AD-ben.
Ezután nagy áteresztőképességű MS-replikációs elemzést (CSF-replikáció 1) alkalmaztunk, hogy a 271 biomarker-készletünket a legígéretesebb és reprodukálhatóbb célokra szűkítsük (5A. ábra). A CSF 1. példánya összesen 96 mintát tartalmaz az Emory Goizueta ADRC-ből, beleértve a kontrollt, az AsymAD-t és az AD kohorszt (S1A táblázat). Ezeket az AD-eseteket enyhe kognitív hanyatlás (átlag MoCA, 20,0 ± 3,8) és az AD biomarkerek változása jellemzi a cerebrospinális folyadékban (S1A táblázat). Az általunk talált CSF-analízissel ellentétben ez a replikáció egy hatékonyabb és nagyobb áteresztőképességű „single-shot” MS módszerrel történik (off-line frakcionálás nélkül), beleértve az egyszerűsített minta-előkészítési protokollt, amely kiküszöböli az egyes minták immundepléciójának szükségességét. . Ehelyett egyetlen immunhiányos „fokozó csatornát” használnak a kevésbé bőséges fehérjék jelének erősítésére (37). Bár csökkenti a teljes proteomlefedettséget, ez az egylövéses módszer jelentősen csökkenti a gépi időt, és növeli az életképesként elemezhető TMT-vel jelölt minták számát (17, 38). Összességében az elemzés 6487 peptidet azonosított, amelyek 96 esetben 1183 proteomhoz illeszkedtek. A CSF-analízishez hasonlóan a minták legalább 50%-ában számszerűsített fehérjéket vettük bele a későbbi számításokba, és az adatokat az életkor és a nem hatásaira visszafejtve. Ez 792 proteom végső számszerűsítéséhez vezetett, amelyek 95%-át a talált CSF-adatkészletben is azonosították.
(A) Az agyhoz kapcsolódó CSF-fehérje-célpontok, amelyeket az első replikált CSF-kohorszban ellenőriztek, és szerepeltek a végső panelben (n = 60). (B-től E-ig) Panel biomarker szintek (összetett z-pontszámok) a négy CSF-replikációs kohorszban mérve. Páros t-próbát vagy ANOVA-t Tukey utókorrekciójával alkalmaztunk az abundancia változásainak statisztikai szignifikanciájának értékelésére minden ismétléses elemzésben. CT, kontroll.
Mivel különösen érdekelt bennünket 271 agyhoz kapcsolódó CSF-célpontunk átfogó elemzése révén történő ellenőrzése, ennek a replikált proteomnak a további vizsgálatát ezekre a markerekre korlátozzuk. A 271 fehérje közül 100-at detektáltunk az 1. CSF-replikációban. Az S6A ábra e 100 átfedő marker eltérő expresszióját mutatja a kontroll és az AD replikációs minták között. A szinaptikus és metabolit hisztonok nőnek leginkább AD-ben, míg a vaszkuláris fehérjék csökkennek leginkább betegségben. A 100 átfedő marker többsége (n = 70) ugyanazt a változási irányt tartotta a két adatkészletben (S6B ábra). Ez a 70 validált agyvel kapcsolatos CSF-marker (S2H táblázat) nagymértékben tükrözi a korábban megfigyelt panel expressziós trendeket, vagyis az érfehérjék leszabályozását és az összes többi panel felszabályozását. A 70 validált fehérje közül csak 10 mutatott olyan változást az AD bőségében, amely ellentmondott ezeknek a paneltrendeknek. Annak érdekében, hogy egy olyan panelt hozzunk létre, amely a legjobban tükrözi az agy és az agy-gerincvelői folyadék általános trendjét, kizártuk ezt a 10 fehérjét az érdeklődési körből, amelyet végül ellenőriztünk (5A ábra). Ezért panelünk végül összesen 60 fehérjét tartalmaz, amelyeket két független CSF AD kohorszban ellenőriztek különböző minta-előkészítés és MS platform elemzés segítségével. Ezeknek a végső paneleknek a z-score expressziós görbéi a CSF 1. kópia kontroll és AD esetekben megerősítették az általunk talált CSF kohorszban megfigyelt paneltrendet (5B. ábra).
A 60 fehérje között vannak olyan molekulák, amelyekről ismert, hogy összefüggésbe hozhatók az AD-vel, mint például az osteopontin (SPP1), amely egy gyulladást elősegítő citokin, amelyet számos tanulmányban összefüggésbe hoztak az AD-vel (39-41), és a GAP43, a szinaptikus fehérje. ami egyértelműen a neurodegenerációhoz kapcsolódik (42). A legteljesebben igazolt fehérjék olyan markerek, amelyek más neurodegeneratív betegségekhez kapcsolódnak, mint például az amiotrófiás laterális szklerózishoz (ALS) összefüggő szuperoxid-diszmutáz 1 (SOD1) és a Parkinson-kórhoz kapcsolódó dezacharáz (PARK7). Azt is igazoltuk, hogy sok más marker, mint például a SMOC1 és az agyban gazdag membrántkötő jelátviteli fehérje 1 (BASP1), korlátozott korábbi kapcsolatokat mutat a neurodegenerációval. Érdemes megjegyezni, hogy a CSF-proteomban való alacsony általános abundanciájuk miatt nehéz számunkra ezt a nagy áteresztőképességű, egylövetű kimutatási módszert a MAPT és bizonyos más, AD-val kapcsolatos fehérjék (például NEFL és NRGN) megbízható kimutatására használni. ) ( 43, 44).
Ezután három további párhuzamos elemzésben ellenőriztük ezt a 60 prioritási panel markert. A CSF 2. példányában egyetlen TMT-MS-t használtunk az Emory Goizueta ADRC-ből származó 297 kontroll- és AD-mintából álló független kohorsz elemzésére (17). A 3. CSF-replikáció magában foglalta a svájci Lausanne-ból származó 120 kontroll- és AD-beteg elérhető TMT-MS-adatainak újraelemzését (45). Minden adatkészletben a 60 prioritásjelző több mint kétharmadát észleltük. Bár a svájci tanulmány különböző MS platformokat és TMT kvantifikációs módszereket használt (45, 46), két ismételt elemzésben (5. ábra, C és D, valamint S2, I és J táblázatok) erőteljesen reprodukáltuk paneltrendeinket. Csoportunk betegségspecifitásának értékelésére TMT-MS segítségével elemeztük a negyedik replikációs adatsort (CSF replikáció 4), amely nemcsak kontroll (n = 18) és AD (n = 17) eseteket tartalmazott, hanem PD (n = 17) eseteket is. n = 14), ALS (n = 18) és frontotemporális demencia (FTD) minták (n = 11) (S1A táblázat). Sikeresen kvantifikáltuk a panelfehérjék közel kétharmadát ebben a kohorszban (60-ból 38). Ezek az eredmények kiemelik az AD-specifikus változásokat mind az öt biomarker panelen (5E ábra és S2K táblázat). A metabolit csoport növekedése mutatta a legerősebb AD specificitást, ezt követte a myelinizációs és glia csoport. Kisebb mértékben az FTD is növekedést mutat e panelek között, ami hasonló lehetséges hálózati változásokat tükrözhet (17). Ezzel szemben az ALS és a PD majdnem ugyanazt a myelinizációs, glia- és metabolómprofilt mutatta, mint a kontrollcsoport. Összességében, a minta-előkészítés, az MS platform és a TMT kvantifikációs módszerei közötti különbségek ellenére ezek az ismételt elemzések azt mutatják, hogy a prioritási panel markereink rendkívül konzisztens AD-specifikus változásokat mutatnak több mint 500 egyedi CSF-mintában.
Az AD neurodegenerációját már több évvel a kognitív tünetek megjelenése előtt széles körben felismerték, ezért sürgősen szükség van az AsymAD biomarkereire (5, 31). Mindazonáltal egyre több bizonyíték mutatja, hogy az AsymAD biológiája korántsem homogén, és a kockázat és a reziliencia összetett kölcsönhatása nagy egyéni különbségekhez vezet a betegség későbbi progressziójában (47). Bár az AsymAD esetek azonosítására használták, a CSF-biomarkerek (Aβ1-42, teljes tau és p-tau) szintjei nem bizonyították, hogy megbízhatóan megjósolhatnák, ki fog demenciába fejlődni (4, 7), ami arra utal, hogy Az agy fiziológiájának számos aspektusán alapuló holisztikus biomarker eszközök beépítése szükséges e populáció kockázatának pontos rétegezéséhez. Ezért ezt követően elemeztük AD-validált biomarker panelünket a CSF 1. kópia AsymAD populációjában. Ez a 31 AsymAD eset rendellenes mag biomarker szintet (Aβ1–42/teljes tau ELISA arány, <5,5) és teljes megismerést (átlag MoCA, 27,1) mutatott. ± 2,2) (S1A táblázat). Ezenkívül minden AsymAD-ben szenvedő egyén klinikai demencia pontszáma 0, ami azt jelzi, hogy nincs bizonyíték a napi kognitív vagy funkcionális teljesítmény csökkenésére.
Először elemeztük a validált panelek szintjeit mind a 96 CSF-replikációban 1, beleértve az AsymAD kohorszot is. Azt találtuk, hogy az AsymAD csoportban több panel szignifikáns AD-szerű abundancia-változást mutatott, a vaszkuláris panel az AsymAD esetében csökkenő tendenciát mutatott, míg az összes többi panel emelkedő tendenciát mutatott (6A ábra). Ezért minden panel nagyon szignifikáns korrelációt mutatott az ELISA Aβ1-42-vel és a teljes tau-szinttel (6B. ábra). Ezzel szemben a csoport és a MoCA pontszám közötti korreláció viszonylag gyenge. Ezeknek az elemzéseknek az egyik legszembetűnőbb eredménye az AsymAD kohorszban a panelek széles skálája. A 6A. ábrán látható módon az AsymAD csoport panelszintje általában keresztezi a kontrollcsoport és az AD csoport panelszintjét, ami viszonylag nagy variabilitást mutat. Az AsymAD heterogenitásának további feltárása érdekében többdimenziós skálázási (MDS) elemzést alkalmaztunk 96 CSF replikációs 1 esetben. Az MDS elemzés lehetővé teszi az esetek közötti hasonlóság megjelenítését az adatkészlet bizonyos változói alapján. Ehhez a klaszteranalízishez csak azokat a validált panelmarkereket használjuk, amelyek statisztikailag szignifikáns változást mutatnak (P <0,05, AD/kontroll) a CSF felfedezési és replikációs 1. proteomjában (n = 29) (S2L táblázat). Ez az elemzés egyértelmű térbeli klaszterezést eredményezett a kontroll és az AD esetek között (6C. ábra). Ezzel szemben egyes AsymAD esetek egyértelműen a kontrollcsoportba csoportosulnak, míg mások az AD esetekben találhatók. Az AsymAD heterogenitás további feltárása érdekében az MDS térképünket használtuk az AsymAD esetek két csoportjának meghatározására. Az első csoportba a kontrollhoz közelebb klaszterezett AsymAD esetek (n = 19), míg a második csoportba az AD-hez közelebbi markerprofilú AsymAD esetek voltak jellemzőek (n = 12).
(A) A CSF biomarkercsoport expressziós szintje (z-score) a CSF 1. replikációs kohorsz mind a 96 mintájában, beleértve az AsymAD-t is. A Tukey-féle utókorrekcióval végzett varianciaanalízis segítségével értékeltük a panel bőség változásának statisztikai szignifikanciáját. (B) A panel fehérje bőség szintjének (z-score) korrelációs elemzése a MoCA pontszámmal és a teljes tau szinttel ELISA Aβ1-42 és CSF kópia 1 mintákban. Megjelenik a Pearson korrelációs együttható a megfelelő P értékkel. (C) 96 CSF 1. kópia eset MDS-értéke 29 validált panelmarker abundanciaszintjén alapult, amelyek mind a felfedezés, mind a CSF 1. kópia adatkészletében szignifikánsan megváltoztak [P <0,05 AD/kontroll (CT)]. Ezzel az elemzéssel az AsymAD csoportot kontroll (n = 19) és AD (n = 12) alcsoportokra osztottuk. (D) A vulkán diagram az összes CSF replikációs 1 fehérje differenciált expresszióját mutatja log2-szeres változással (x tengely) a -log10 statisztikai P értékhez képest a két AsymAD alcsoport között. A panel biomarkerei színesek. (E) A szelekciós csoport biomarkereinek CSF-replikációjának 1. gyakorisági szintje eltérően fejeződik ki az AsymAD alcsoportok között. A statisztikai szignifikancia értékelésére Tukey utólagos korrigált varianciaanalízisét használtuk.
Megvizsgáltuk az eltérő fehérjeexpressziót ezen kontroll és az AD-szerű AsymAD esetek között (6D ábra és S2L táblázat). Az így kapott vulkántérkép azt mutatja, hogy 14 panelmarker jelentősen megváltozott a két csoport között. A legtöbb ilyen marker a szinapszis és a metabolóm tagja. Azonban a SOD1 és a mirisztoilezett alaninban gazdag protein kináz C szubsztrát (MARCKS), amelyek a mielin és a glia immuncsoport tagjai, szintén ebbe a csoportba tartoznak (6. ábra, D és E). A vaszkuláris panel két markert is tartalmazott, amelyek szignifikánsan csökkentek az AD-szerű AsymAD csoportban, beleértve az AE-kötő fehérjét 1 (AEBP1) és a komplement családtagot, a C9-et. Nem volt szignifikáns különbség a kontroll és az AD-szerű AsymAD alcsoportok között az ELISA AB1-42 (P = 0,38) és a p-tau (P = 0,28), de valóban volt szignifikáns különbség a teljes tau-szintben (P = 0,0031) ) (S7. ábra). Számos panel marker jelzi, hogy a két AsymAD alcsoport közötti változások szignifikánsabbak, mint a teljes tau szint (például YWHAZ, SOD1 és MDH1) (6E ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy validált panelünk biomarkereket tartalmazhat, amelyek altípusba sorolhatják és potenciálisan veszélyeztethetik a tünetmentes betegségben szenvedő betegeket.
Sürgősen szükség van rendszeralapú biomarker eszközökre az AD mögött meghúzódó különféle patofiziológiák jobb mérésére és megcélzására. Ezek az eszközök várhatóan nemcsak AD diagnosztikai keretünket változtatják meg, hanem hatékony, betegspecifikus kezelési stratégiák elfogadását is elősegítik (1, 2). Ebből a célból elfogulatlan átfogó proteomikai megközelítést alkalmaztunk az AD agyban és a CSF-ben, hogy azonosítsuk a webalapú CSF biomarkereket, amelyek az agy alapú patofiziológiájának széles skáláját tükrözik. Elemzésünk öt CSF biomarker panelt hozott létre, amelyek (i) tükrözik a szinapszisokat, az ereket, a mielint, az immunrendszeri és metabolikus diszfunkciókat; ii. erős reprodukálhatóságot mutatnak be különböző tagállami platformokon; (iii) Mutasson progresszív betegség-specifikus változásokat az AD korai és késői szakaszában. Összességében ezek az eredmények ígéretes lépést jelentenek a változatos, megbízható, web-orientált biomarker eszközök fejlesztése felé az AD-kutatás és a klinikai alkalmazások számára.
Eredményeink demonstrálják az AD agyhálózati proteomjának erősen konzervált szervezetét, és alátámasztják annak használatát a rendszer alapú biomarker-fejlesztés horgonyjaként. Elemzésünk azt mutatja, hogy két független TMT-MS adatkészlet, amely AD és AsymAD agyakat tartalmaz, erős modularitású. Ezek az eredmények kibővítik korábbi munkánkat, demonstrálva a több mint 2000 agyszövet erőteljes moduljainak megőrzését több független kohorszból a frontális, a parietális és a temporális kéregben (17). Ez a konszenzusos hálózat tükrözi a jelenlegi kutatásokban megfigyelt különböző, betegséggel kapcsolatos változásokat, beleértve a glia-gazdag gyulladásos modulok növekedését és a neuronokban gazdag modulok csökkenését. A jelenlegi kutatásokhoz hasonlóan ez a nagyszabású hálózat is jelentős moduláris változásokat mutat be az AsymAD-ban, számos különböző preklinikai patofiziológiát mutatva (17).
Ebben az erősen konzervatív rendszeralapú keretben azonban finomabb biológiai heterogenitás tapasztalható, különösen az AD korai szakaszában lévő egyedek között. Biomarker panelünk két alcsoportot képes ábrázolni az AsymAD-ben, amelyek több CSF marker jelentős eltérő expresszióját mutatják be. Csoportunk képes volt rávilágítani a két alcsoport közötti biológiai különbségekre, amelyek az AD biomarkerek szintjén nem voltak nyilvánvalóak. A kontrollcsoporthoz képest ezen AsymAD egyedek Aβ1-42/teljes tau aránya abnormálisan alacsony volt. A két AsymAD alcsoportban azonban csak a teljes tau szint különbözött szignifikánsan, míg az Aβ1-42 és a p-tau szintek viszonylag összehasonlíthatóak maradtak. Mivel a magas CSF tau a kognitív tünetek jobb előrejelzője, mint az Aβ1-42 szint (7), gyanítjuk, hogy a két AsymAD kohorsz eltérő kockázattal járhat a betegség progressziójával kapcsolatban. Tekintettel az AsymAD korlátozott mintaszámára és a longitudinális adatok hiányára, további kutatásokra van szükség ahhoz, hogy magabiztosan levonhassuk ezeket a következtetéseket. Ezek az eredmények azonban azt mutatják, hogy a rendszer alapú CSF-panel javíthatja azon képességünket, hogy hatékonyan rétegezzük az egyéneket a betegség tünetmentes szakaszában.
Eredményeink összességében alátámasztják több biológiai funkció szerepét az AD patogenezisében. A szabályozatlan energiaanyagcsere azonban mind az öt validált címkézési panelünk kiemelkedő témája lett. A metabolikus fehérjék, mint például a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz 1 (HPRT1) és a laktát-dehidrogenáz A (LDHA), a legerősebben validált szinaptikus biomarkerek, ami azt jelzi, hogy az AD CSF növekedése nagymértékben reprodukálható nem. Vérereink és gliapaneleink számos markert is tartalmaznak, amelyek részt vesznek az oxidatív anyagok anyagcseréjében. Ezek az eredmények összhangban vannak azzal a kulcsfontosságú szereppel, amelyet a metabolikus folyamatok az egész agyban játszanak, nemcsak az idegsejtek magas energiaigényének kielégítésében, hanem az asztrociták és más gliasejtek magas energiaigényének kielégítésében is (17, 48). Eredményeink alátámasztják az egyre több bizonyítékot arra vonatkozóan, hogy a redoxpotenciál változásai és az energiautak megszakadása lehet a központi kapcsolat az AD patogenezisében részt vevő számos kulcsfontosságú folyamat között, beleértve a mitokondriális rendellenességeket, a glia által közvetített gyulladást és az érrendszeri károsodást (49). Ezenkívül a metabolikus cerebrospinális folyadék biomarkerei nagyszámú, eltérően gazdag fehérjét tartalmaznak a kontroll és az AD-szerű AsymAD alcsoportok között, ami arra utal, hogy ezeknek az energia- és redoxutaknak a megzavarása kritikus lehet a betegség preklinikai szakaszában.
Az általunk megfigyelt különböző agyi és agy-gerincvelői folyadék panel tendenciáknak is vannak érdekes biológiai vonatkozásai. A neuronokban gazdag szinapszisok és metabolómák csökkent szintet mutatnak az AD agyban és megnövekedett mennyiséget a cerebrospinális folyadékban. Tekintettel arra, hogy a neuronok a szinapszisokban gazdagok energiatermelő mitokondriumokban, hogy energiát biztosítsanak számos speciális jelükhöz (50), e két neuroncsoport expressziós profiljainak hasonlósága várható. A neuronok elvesztése és a sérült sejtek extrudálása megmagyarázhatja ezeket az agyi és CSF-panel tendenciákat a későbbi betegségekben, de nem magyarázhatják meg az általunk megfigyelt korai panelváltozásokat (13). A korai tünetmentes betegségek egyik lehetséges magyarázata az abnormális szinaptikus metszés. Az egérmodellekben szerzett új bizonyítékok arra utalnak, hogy a mikroglia által közvetített szinaptikus fagocitózis kórosan aktiválódhat AD-ben, és korai szinapszisvesztéshez vezethet az agyban (51). Ez az eldobott szinaptikus anyag felhalmozódhat a CSF-ben, ezért figyeljük meg a CSF növekedését a neuron panelen. Az immunmediált szinaptikus metszés részben megmagyarázhatja a gliafehérjék növekedését, amelyet az agyban és a liquorban figyelünk meg a betegség folyamata során. A szinaptikus metszés mellett az exocita útvonal általános rendellenességei is a neuronális markerek eltérő agyi és CSF-expressziójához vezethetnek. Számos tanulmány kimutatta, hogy az AD agy patogenezisében az exoszómák tartalma megváltozott (52). Az extracelluláris útvonal az Aβ proliferációjában is részt vesz (53, 54). Érdemes megjegyezni, hogy az exoszómális szekréció elnyomása csökkentheti az AD-szerű patológiát AD transzgenikus egérmodellekben (55).
Ugyanakkor a vaszkuláris panel fehérje mérsékelt növekedést mutatott az AD agyban, de szignifikánsan csökkent a CSF-ben. A vér-agy gát (BBB) diszfunkciója részben megmagyarázhatja ezeket az eredményeket. Számos független posztmortem humán tanulmány kimutatta a BBB lebomlását AD-ben (56, 57). Ezek a vizsgálatok megerősítették az endothelsejtek e szorosan lezárt rétegét körülvevő különféle abnormális tevékenységeket, beleértve az agyi kapillárisok szivárgását és a vérben terjedő fehérjék perivascularis felhalmozódását (57). Ez egyszerű magyarázatot adhat az agyban megemelkedett vaszkuláris fehérjékre, de nem tudja teljes mértékben megmagyarázni ugyanezen fehérjék kimerülését a cerebrospinális folyadékban. Az egyik lehetőség az, hogy a központi idegrendszer aktívan izolálja ezeket a molekulákat, hogy megoldja a fokozott gyulladás és az oxidatív stressz problémáját. Ezen a panelen a legsúlyosabb CSF-fehérjék csökkenése, különösen a lipoprotein-szabályozásban részt vevők, a gyulladás káros szintjének gátlásával és a reaktív oxigénfajták neuroprotektív folyamatával kapcsolatos. Ez igaz a Paroxonase 1-re (PON1), egy lipoprotein-kötő enzimre, amely a keringési oxidatív stressz szintjének csökkentéséért felelős (58, 59). Az alfa-1-mikroglobulin/bikunin prekurzor (AMBP) a vaszkuláris csoport másik jelentősen csökkentett markere. A bikunin lipidtranszporter prekurzora, amely szintén részt vesz a gyulladás elnyomásában és a neurológiai védelemben (60, 61).
A különféle érdekes hipotézisek ellenére a biokémiai betegségek mechanizmusainak közvetlen kimutatásának képtelensége a felfedezés-vezérelt proteomikai elemzés jól ismert korlátja. Ezért további kutatásra van szükség a biomarker panelek mögötti mechanizmusok magabiztos meghatározásához. Az SM-alapú klinikai elemzés fejlesztése felé való elmozdulás érdekében a jövő iránya megköveteli a célzott kvantitatív módszerek alkalmazását is a nagyléptékű biomarker-verifikációhoz, mint például a szelektív vagy párhuzamos reakciómonitoring (62). A közelmúltban párhuzamos reakciómonitorozást (63) alkalmaztunk az itt leírt CSF-fehérje-változások számosságának validálására. Számos kiemelt panelcélt jelentős pontossággal számszerűsítettek, köztük az YWHAZ-t, az ALDOA-t és a SMOC1-et, amelyek rendre a szinapszis-, az anyagcsere- és a gyulladáspaneleinkre vonatkoznak (63). Az Independent Data Acquisition (DIA) és más MS-alapú stratégiák szintén hasznosak lehetnek a célellenőrzéshez. Bud et al. (64) Nemrég kimutatták, hogy jelentős átfedés van a CSF-felfedezési adatkészletünkben azonosított AD biomarkerek és a független DIA-MS adatkészlet között, amely három különböző európai kohorszból származó közel 200 CSF-mintából áll. Ezek a közelmúltbeli tanulmányok alátámasztják a paneleinkben rejlő potenciált, hogy megbízható MS-alapú észleléssé váljanak. A kulcsfontosságú AD biomarkerek továbbfejlesztése szempontjából is fontos a hagyományos antitest- és aptamer-alapú kimutatás. A CSF alacsony előfordulása miatt nehezebb ezeket a biomarkereket kimutatni nagy áteresztőképességű MS módszerekkel. A NEFL és az NRGN két ilyen példa az alacsony abundanciájú CSF biomarkerekre, amelyeket átfogó elemzésünk során a panelhez társítottunk, de egyetlen MS stratégiánkkal nem lehet megbízhatóan kimutatni. A több antitesten, például PEA-n alapuló célzási stratégiák elősegíthetik e markerek klinikai átalakulását.
Összességében ez a tanulmány egyedülálló proteomikai megközelítést kínál a különböző rendszereken alapuló CSF AD biomarkerek azonosítására és ellenőrzésére. Ezeknek a markerpaneleknek a további AD-kohorszokon és MS-platformokon történő optimalizálása ígéretesnek bizonyulhat az AD-kockázati rétegződés és -kezelés előmozdítása érdekében. Azok a vizsgálatok, amelyek ezen panelek longitudinális szintjét idővel értékelik, szintén kritikusak annak meghatározásához, hogy a markerek melyik kombinációja rétegzi a legjobban a korai betegségek kockázatát és a betegség súlyosságának változásait.
A CSF által másolt 3 minta kivételével az ebben a tanulmányban használt összes CSF-mintát az Emory ADRC vagy szorosan kapcsolódó kutatóintézetek égisze alatt gyűjtötték. Ezekben a proteomikai vizsgálatokban összesen négy Emory CSF-mintát használtak. A CSF-kohorsz 20 egészséges kontroll és 20 AD-beteg mintáit tartalmazza. A CSF 1. példánya 32 egészséges kontrolltól, 31 AsymAD egyéntől és 33 AD egyéntől származó mintákat tartalmaz. A CSF 2. példánya 147 kontrollt és 150 AD-mintát tartalmaz. A több betegséggel járó CSF-replikációs 4. kohorsz 18 kontrollt, 17 AD-, 19 ALS-, 13 PD- és 11 FTD-mintát tartalmazott. Az Emory Egyetem Intézményi Felülvizsgáló Testülete által jóváhagyott megállapodás szerint az Emory-vizsgálat valamennyi résztvevője tájékozott beleegyezést kapott. A 2014-es National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) szerint a cerebrospinális folyadékot lumbálpunkcióval gyűjtötték össze és tárolták. A kontroll és az AsymAD és AD betegek standardizált kognitív értékelést kaptak az Emory Kognitív Neurológiai Klinikán vagy a Goizueta ADRC-n. A liquormintáikat INNO-BIA AlzBio3 Luminex teszttel vizsgálták ELISA Aβ1-42, teljes tau és p-tau analízisre (65 ). Az ELISA-értékeket az alanyok diagnosztikai osztályozásának alátámasztására használják a megállapított AD biomarker-kritériumok alapján (66, 67). Az egyéb CSF-diagnózisok (FTD, ALS és PD) alapvető demográfiai és diagnosztikai adatait szintén az Emory ADRC-től vagy kapcsolódó kutatóintézetektől szerezzük be. Az Emory CSF-esetek összefoglaló metaadatai az S1A táblázatban találhatók. A svájci CSF replikációs 3. kohorsz jellemzőit korábban publikálták (45).
A CSF megtalálta a mintát. A CSF-adatokkal kapcsolatos felfedezésünk mélyebbé tétele érdekében a tripszinezés előtt nagy mennyiségben előforduló fehérjék immunfogyasztását végeztük el. Röviden: 40 egyedi CSF-mintából 130 μl CSF-et és azonos térfogatú (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin-t (Thermo Fisher Scientific, A36372) helyeztünk egy spin oszlopba (Thermo Fisher Scientific, A89868) a szobában. hőmérséklet Inkubálás). 15 perces centrifugálás után centrifugálja a mintát 1000 g-vel 2 percig. 3K ultracentrifugális szűrőkészüléket (Millipore, UFC500396) használtunk a kifolyó minta koncentrálására 14 000 g-vel 30 percig végzett centrifugálással. Hígítsa fel az összes mintamennyiséget 75 μl-re foszfáttal pufferolt sóoldattal. A fehérjekoncentrációt bicinchoninsav (BCA) módszerrel értékeltük a gyártó (Thermo Fisher Scientific) protokollja szerint. Mind a 40 mintából származó immundepletált CSF-et (60 μl) lizil endopeptidázzal (LysC) és tripszinnel emésztettük. Röviden, a mintát redukáltuk és alkileztük 1,2 μl 0,5 M trisz-2(-karboxietil)-foszfinnal és 3 μl 0,8 M klóracetamiddal 90 °C-on 10 percig, majd 15 percig ultrahanggal kezeltük vízfürdőben. A mintát 193 μl 8 M karbamid pufferrel [8 M karbamid és 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] 6 M karbamid végkoncentrációra hígítottuk. LysC-t (4,5 μg; Wako) használunk egy éjszakán át szobahőmérsékleten végzett emésztéshez. A mintát ezután 1 M karbamidra hígítottuk 50 mM ammónium-hidrogén-karbonáttal (ABC) (68). Adjon hozzá azonos mennyiségű (4,5 μg) tripszint (Promega), majd inkubálja a mintát 12 órán át. Az emésztett peptidoldatot 1%-os hangyasav (FA) és 0,1%-os trifluor-ecetsav (TFA) végkoncentrációra savanyítjuk (66), majd sótalanítsuk 50 mg-os Sep-Pak C18 oszlopon (Waters) a fent leírtak szerint (25). . A peptidet ezután 1 ml 50%-os acetonitrilben (ACN) eluáljuk. A fehérje mennyiségi meghatározásának standardizálása érdekében a tételekben (25) mind a 40 CSF-mintából 100 μl-es alikvotokat egyesítettek, hogy vegyes mintát hozzunk létre, amelyet öt globális belső standard (GIS) (48) mintára osztottunk. Minden egyedi mintát és kombinált standardot nagy sebességű vákuumban szárítanak (Labconco).
A CSF lemásolja a mintát. Dayon és munkatársai korábban leírták az immunrendszer kimerülését és a CSF 3. példányának emésztését (45, 46). A fennmaradó ismétlődő minták egyénileg nem voltak immundepletáltak. Emésztsük meg ezeket a nem eltávolított mintákat tripszinben a korábban leírtak szerint (17). Minden megismételt analízishez az egyes mintákból származó eluált peptid 120 μl-es alikvotjait egyesítettük, és egyenlő térfogatú aliquot részekre osztottuk, hogy TMT-vel jelölt globális belső standardként használjuk fel (48). Minden egyedi mintát és kombinált standardot nagy sebességű vákuumban szárítanak (Labconco). Az alacsony abundanciájú CSF fehérje jelének fokozása érdekében, minden mintából 125 μl kombinálásával, minden ismétléses elemzéshez egy „fokozott” mintát készítettek [azaz egy biológiai mintát, amely utánozza a kutatási mintát, de a rendelkezésre álló mennyiség sokkal nagyobb (37, 69)] kevert CSF-mintává egyesült (17). A kevert mintát ezután immunore eltávolítottuk 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) felhasználásával, a fent leírtak szerint emésztettük, és a későbbi többszörös TMT-jelölésbe bevontuk.
Feladás időpontja: 2021. augusztus 27