Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A termofilek olyan mikroorganizmusok, amelyek magas hőmérsékleten szaporodnak. Tanulmányozásuk értékes információkkal szolgálhat arról, hogyan alkalmazkodik az élet a szélsőséges körülményekhez. A hagyományos optikai mikroszkópokkal azonban nehéz magas hőmérsékleti feltételeket elérni. Számos, helyi ellenállásos elektromos fűtésre épülő házi megoldást javasoltak, de nincs egyszerű kereskedelmi megoldás. Ebben a cikkben bemutatjuk a mikroszkóp látómezeje feletti mikroméretű lézerfűtést, amely magas hőmérsékletet biztosít a termofil vizsgálatokhoz, miközben a felhasználó környezetét enyhén tartja. Mérsékelt lézerintenzitású mikroméretű melegítés érhető el arany nanorészecskékkel bevont szubsztrátum használatával, mint biokompatibilis és hatékony fényelnyelő. A mikroméretű folyadékkonvekció, a sejtretenció és a centrifugális termoforetikus mozgás lehetséges hatásait tárgyaljuk. A módszert két fajban demonstrálták: (i) Geobacillus stearothermophilus, egy aktív termofil baktérium, amely körülbelül 65 °C-on szaporodik, és megfigyeltük, hogy mikroméretű melegítés mellett csírázik, nő és úszik; (ii) Thiobacillus sp., optimálisan hipertermofil archaea. 80°C-on. Ez a munka megnyitja az utat a termofil mikroorganizmusok egyszerű és biztonságos megfigyeléséhez modern és megfizethető mikroszkópos eszközökkel.
Évmilliárdok alatt a Földön az élet úgy fejlődött, hogy alkalmazkodjon a környezeti feltételek széles skálájához, amelyeket emberi szempontból néha szélsőségesnek tartanak. Különösen egyes termofil mikroorganizmusok (baktériumok, archaeák, gombák), amelyeket termofileknek neveznek, a 45°C és 122°C közötti hőmérsékleti tartományban szaporodnak. vagy vulkáni területeken. Kutatásaik nagy érdeklődést váltottak ki az elmúlt néhány évtizedben, legalább két okból. Először is megtudhatjuk tőlük, hogy az 5-ös, 6-os termofilek, a 7-es, 8-as enzimek és a 9-es membránok hogyan stabilak ilyen magas hőmérsékleten, vagy hogy a termofilek hogyan tudnak ellenállni a szélsőséges sugárzásnak10. Másodszor, számos fontos biotechnológiai alkalmazás1,11,12 alapját képezik, mint például az üzemanyag-előállítás13,14,15,16, kémiai szintézis (dihidro, alkoholok, metán, aminosavak stb.)17, biobányászat18 és hőstabil biokatalizátorok7,11, 13. A jelenleg jól ismert polimeráz láncreakció (PCR)19 egy enzimet (Taq polimeráz) foglal magában, amelyet a Thermus aquaticus termofil baktériumból izoláltak, amely az egyik első felfedezett termofil baktérium.
A termofilek tanulmányozása azonban nem könnyű feladat, és egyetlen biológiai laboratóriumban sem improvizálható. Különösen az élő termofilek nem figyelhetők meg in vitro egyetlen szabványos fénymikroszkóppal sem, még a kereskedelemben kapható fűtőkamrákkal sem, amelyeket általában 40°C-os hőmérsékletre mértek. Az 1990-es évek óta csak néhány kutatócsoport szentelte magát a magas hőmérsékletű mikroszkópos (HTM) rendszerek bevezetésének. 1994-ben Glukh et al. A fűtő/hűtő kamra egy Peltier-cella felhasználásán alapult, amely szabályozza a négyszögletes kapillárisok hőmérsékletét, zárva tartva az anaerobicitást 20 . A készülék 100 °C-ra fűthető 2 °C/s sebességgel, így a szerzők tanulmányozhatják a Thermotoga maritima21 hipertermofil baktérium mozgékonyságát. 1999-ben Horn et al. Egy nagyon hasonló eszközt fejlesztettek ki, amely továbbra is kereskedelmi mikroszkópiára alkalmas fűtött kapillárisok használatán alapul a sejtosztódás/kapcsolat tanulmányozására. Hosszú relatív inaktivitás után 2012-ben újraindult a hatékony HTM-ek keresése, különösen a Wirth-csoport azon cikkeivel kapcsolatban, amelyek Horn és munkatársai által feltalált eszközt használtak. Tizenöt évvel ezelőtt nagyszámú archaea, köztük hipertermofil motilitását vizsgálták 100°C-ig fűtött kapillárisok segítségével23,24. Módosították az eredeti mikroszkópot is, hogy gyorsabb melegítést érjenek el (a beállított hőmérséklet eléréséhez több perc 35 perc helyett), és 2 cm-nél nagyobb lineáris hőmérsékleti gradienst érjenek el a közegben. Ezt a hőmérsékleti gradiens alakító eszközt (TGFD) számos termofil mobilitásának tanulmányozására használták a hőmérsékleti gradienseken belül biológiailag releváns távolságokban 24, 25 .
A zárt kapillárisok fűtése nem az egyetlen módja az élő termofilek megfigyelésének. 2012-ben Kuwabara et al. Házi készítésű, hőálló ragasztóval lezárt, eldobható Pyrex kamrákat (Super X2; Cemedine, Japán) használtak. A mintákat egy kereskedelmi forgalomban kapható átlátszó fűtőlapra (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japán) helyezték, amely 110°C-ig képes felmelegedni, de eredetileg nem bioképalkotásra szánták. A szerzők az anaerob termofil baktériumok (Thermosipho globiformans, duplázódási idő 24 perc) hatékony osztódását figyelték meg 65°C-on. 2020-ban Pulshen et al. A kereskedelmi forgalomban kapható fémtányérok (AttofluorTM, Thermofisher) hatékony melegítését két házi készítésű fűtőelem: egy fedél és egy színpad (PCR-gép által ihletett konfiguráció) segítségével demonstrálták. Ez a társulás egyenletes folyadékhőmérsékletet eredményez, és megakadályozza a párolgást és a páralecsapódást a fedél alján. Az O-gyűrű használatával elkerülhető a környezettel való gázcsere. Ezt a Sulfoscope-nak nevezett HTM-et használták a Sulfolobus acidocaldarius leképezésére 75°C27 hőmérsékleten.
Valamennyi rendszer elismert korlátja a légobjektívek használatának korlátozása volt, mivel az olajmerítés nem alkalmas ilyen magas hőmérsékletre és 1 mm-nél vastagabb átlátszó mintákon történő leképezésre. Valamennyi rendszer elismert korlátja a légobjektívek használatának korlátozása volt, mivel az olajmerítés nem alkalmas ilyen magas hőmérsékletre és 1 mm-nél vastagabb átlátszó mintákon történő leképezésre. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективсков, объективов, погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачны через прозрачны Valamennyi rendszer felismert hiányossága a légobjektívek használatának korlátozása, mivel az olajmerítés nem volt alkalmas ilyen magas hőmérsékletre és az 1 mm-nél nagyobb vastagságú átlátszó mintákon keresztül történő megjelenítésre.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适叹浸都不适吂嚿毫米厚的透明样品成像. Mindezen rendszerek elismert korlátja a levegővel bevont tükör használatának korlátozása, mivel az olajmerítés nem alkalmas 1 mm-nél vastagabb átlátszó minták ilyen magas hőmérsékleten történő leképezésére. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушорных обюмовое, люморны ужение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы нол1щицы нол1щих температур и визуализации через прозрачные образцы ноля таких высоких температур и визуализации Valamennyi rendszer elismert hátránya a léglencsék korlátozott használata, az olajmerítés alkalmatlan ilyen magas hőmérsékleten és az 1 mm-nél vastagabb átlátszó mintákon keresztül történő megjelenítés.A közelmúltban ezt a korlátozást Charles-Orzag és munkatársai oldották fel. 28, aki kifejlesztett egy olyan készüléket, amely már nem a vizsgált rendszer körül, hanem magában a fedőüvegen belül ad hőt, ITO-ból (indium-ón-oxid) készült ellenállás vékony átlátszó rétegével borítva. A fedél 75 °C-ra melegíthető, ha elektromos áramot vezetünk át az átlátszó rétegen. A szerzőnek azonban fel kell melegítenie a lencsét az objektívre, de legfeljebb 65 °C-ra, hogy ne sérüljön meg.
Ezek a munkák azt mutatják, hogy a hatékony, magas hőmérsékletű optikai mikroszkópia fejlesztése nem terjedt el széles körben, gyakran házi készítésű berendezéseket igényel, és gyakran térbeli felbontás árán érhető el, ami komoly hátrány, mivel a termofil mikroorganizmusok nem nagyobbak néhánynál. mikrométerek. A csökkentett fűtési mennyiség a kulcs a HTM három velejáró problémájának megoldásához: a rossz térbeli felbontás, a nagy hőtehetetlenség, amikor a rendszer felmelegszik, és a környező elemek (merítőolaj, objektív… vagy a felhasználó keze) káros felmelegedése extrém hőmérsékleteken. ).
Ebben a cikkben bemutatunk egy HTM-et a termofil megfigyeléshez, amely nem az ellenállásos fűtésen alapul. Ehelyett egy fényelnyelő hordozó lézeres besugárzásával helyi melegítést értünk el a mikroszkóp látóterének egy korlátozott tartományában. A hőmérséklet-eloszlást kvantitatív fázismikroszkóppal (QPM) tettük láthatóvá. A módszer hatékonyságát a Geobacillus stearothermophilus, egy mozgékony termofil baktérium, amely körülbelül 65 °C-on szaporodik, és rövid megkettőződési ideje van (kb. 20 perc), valamint a Sulfolobus shibatae, egy hipertermofil baktérium, amely 80 °C-on optimálisan szaporodik (archaea). illusztrálni. A normál replikációs sebességet és az úszást a hőmérséklet függvényében figyeltük meg. Ezt a lézeres HTM-et (LA-HTM) nem korlátozza a fedőlemez vastagsága vagy az objektív jellege (levegő- vagy olajmerítés). Ez lehetővé teszi bármilyen nagy felbontású objektív használatát a piacon. Ezenkívül nem szenved a hőtehetetlenség miatti lassú felmelegedéstől (azonnali felmelegedést ér el ezredmásodperces léptékben), és csak kereskedelemben kapható alkatrészeket használ. Az egyetlen új biztonsági aggály az erős (általában 100 mW-os) lézersugarak jelenlétével kapcsolatos a készülék belsejében és esetleg a szemen keresztül, amely védőszemüveget igényel.
Az LA-HTM elve az, hogy lézerrel melegítik a mintát lokálisan a mikroszkóp látóterében (1a. ábra). Ehhez a mintának fényelnyelőnek kell lennie. Az ésszerű (100 mW-nál kisebb) lézerteljesítmény használatához nem a folyékony közeg fényelnyelésére hagyatkoztunk, hanem mesterségesen növeltük a minta abszorpcióját oly módon, hogy a hordozót arany nanorészecskékkel vontuk be (1c. ábra). Az arany nanorészecskék fénnyel történő hevítése alapvető fontosságú a termikus plazmonika területén, várhatóan a biomedicinában, a nanokémiában vagy a napfény betakarításában29, 30, 31. Az elmúlt néhány évben ezt az LA-HTM-et számos, a fizika, kémia és biológia termikus plazma alkalmazásaival kapcsolatos tanulmányban alkalmaztuk. Ennek a módszernek a fő nehézsége a végső hőmérsékleti profil megjelenítése, mivel a megemelt hőmérséklet a mintán belüli mikroméretű régióra korlátozódik. Megmutattuk, hogy hőmérséklet-leképezést lehet elérni a négy hullámhosszú keresztirányú nyírási interferométerrel, amely egy egyszerű, nagy felbontású és nagyon érzékeny kvantitatív fázismikroszkópos módszer, amely kétdimenziós diffrakciós rácsok (más néven keresztrácsok) alkalmazásán alapul. 33,34,35,36. Ennek a keresztrácsos hullámfront-mikroszkópián (CGM) alapuló termikus mikroszkópos technika megbízhatóságát az elmúlt évtizedben egy tucatnyi közlemény bizonyította37,38,39,40,41,42,43.
Párhuzamos lézerfűtő, alakító és hőmérséklet mikroszkóp beépítési sémája. b Minta geometria, amely egy arany nanorészecskékkel bevont fedőlemezt tartalmazó AttofluorTM kamrából áll. c Nézze meg alaposan a mintát (nem méretarányosan). d az egyenletes lézersugár-profilt és (e) szimulált későbbi hőmérséklet-eloszlást jelöli az arany nanorészecskék mintasíkján. f egy gyűrű alakú lézersugár-profil, amely alkalmas egyenletes hőmérséklet létrehozására, amint azt a (g) pontban bemutatott kapott hőmérséklet-eloszlás szimulációja mutatja. Skála: 30 µm.
Különösen a közelmúltban értük el az emlőssejtek felmelegítését LA-HTM-mel és CGM-mel, és nyomon követtük a celluláris hősokk-válaszokat 37-42 °C tartományban, bizonyítva ennek a technikának az egyetlen élő sejtes képalkotásban való alkalmazhatóságát. Az LA-HTM alkalmazása a mikroorganizmusok magas hőmérsékleten történő vizsgálatára azonban nem egyértelmű, mivel az emlőssejtekhez képest nagyobb körültekintést igényel: először is, ha a táptalaj alját több tíz fokkal (nem pedig néhány fokkal) melegítjük. erős függőleges hőmérsékleti gradiensre. 44 folyadékkonvekciót hozhat létre, amely, ha nincs szilárdan rögzítve a hordozóhoz, nemkívánatos mozgást és baktériumok keveredését okozhatja. Ez a konvekció a folyadékréteg vastagságának csökkentésével kiküszöbölhető. Ebből a célból az alábbiakban bemutatott összes kísérletben a baktériumszuszpenziókat két körülbelül 15 µm vastag fedőlemez közé helyeztük, amelyeket egy fémpohárba helyeztek (AttofluorTM, Thermofisher, 1b., c. ábra). A konvekció elvileg elkerülhető, ha a folyadék vastagsága kisebb, mint a fűtőlézer nyalábmérete. Másodszor, az ilyen korlátozott geometriában végzett munka megfojthatja az aerob organizmusokat (lásd az S2. ábrát). Ez a probléma elkerülhető oxigén (vagy bármely más létfontosságú gáz) számára áteresztő hordozó használatával, a fedőlemez belsejében rekedt légbuborékok hagyásával, vagy lyukak fúrásával a felső fedőlemezen (lásd S1 ábra) 45 . Ebben a tanulmányban az utóbbi megoldást választottuk (1b. és S1. ábra). Végül a lézeres fűtés nem biztosít egyenletes hőmérséklet-eloszlást. Még a lézersugár azonos intenzitása mellett sem (1d. ábra) a hőmérséklet-eloszlás nem egyenletes, inkább a hődiffúzió miatti Gauss-eloszlásra hasonlít (1e. ábra). Ha a biológiai rendszerek tanulmányozásához a látómező pontos hőmérsékletének megállapítása a cél, az egyenetlen profilok nem ideálisak, és a baktériumok termoforetikus mozgásához is vezethetnek, ha nem tapadnak meg az aljzathoz (lásd S3, S4 ábra)39. Ennek érdekében térbeli fénymodulátorral (SLM) alakítottuk ki az infravörös lézersugarat a minta síkjában lévő gyűrű alakjának megfelelően (1f. ábra), hogy egy adott geometriai területen belül tökéletesen egyenletes hőmérséklet-eloszlást érjünk el. a hődiffúzió ellenére (1d. ábra) 39 , 42, 46. Helyezzen egy felső fedőlemezt egy fémtálra (1b. ábra), hogy elkerülje a közeg elpárolgását, és figyelje meg legalább néhány napig. Mivel ez a felső fedőlemez nincs lezárva, szükség esetén bármikor könnyen hozzáadható további közeg.
Az LA-HTM működésének szemléltetésére és a termofil kutatásban való alkalmazhatóságának bemutatására a Geobacillus stearothermophilus aerob baktériumokat tanulmányoztuk, amelyek optimális növekedési hőmérséklete 60-65°C körüli. A baktérium flagellákkal és úszási képességgel is rendelkezik, ami a normál sejtaktivitás másik mutatója.
A mintákat (1b. ábra) 60 °C-on egy órán át előinkubáltuk, majd LA-HTM mintatartóba helyeztük. Ez az előinkubálás nem kötelező, de még mindig hasznos, két okból: Először is, amikor a lézert bekapcsolják, azonnali növekedést és osztódást okoz a sejtek (lásd az M1 filmet a Kiegészítő anyagokban). Előinkubálás nélkül a baktériumok növekedése általában körülbelül 40 perccel késik minden alkalommal, amikor a mintán új látómezőt melegítenek. Másodszor, az 1 órás előinkubálás elősegítette a baktériumok tapadását a fedőlemezhez, megakadályozva, hogy a sejtek a látómezőből kikerüljenek a termoforézis miatt, amikor a lézert bekapcsolták (lásd az M2 filmet a Kiegészítő anyagokban). A termoforézis részecskék vagy molekulák hőmérsékleti gradiens mentén történő mozgása, általában melegről hidegre, és ez alól a baktériumok sem kivételek43,47. Ez a nemkívánatos hatás egy adott területen kiküszöbölhető az SLM használatával a lézersugár formálására és egyenletes hőmérséklet-eloszlás elérésére.
ábrán. A 2. ábra az arany nanorészecskékkel bevont üveghordozó gyűrű alakú lézersugárral történő besugárzásával kapott CGM-el mért hőmérséklet-eloszlást mutatja (1f. ábra). Lapos hőmérséklet-eloszlást figyeltünk meg a lézersugár által lefedett teljes területen. Ezt a zónát 65°C-ra, az optimális növekedési hőmérsékletre állítottuk be. Ezen a tartományon kívül a hőmérsékleti görbe természetesen \(1/r\) értékre esik (ahol \(r\) a radiális koordináta).
a CGM mérések hőmérsékleti térképe, amelyet egy gyűrű alakú lézersugár segítségével arany nanorészecskék rétegének besugárzásával kapunk, hogy egy kör alakú területen lapos hőmérsékleti profilt kapjunk. b A hőmérsékleti térkép izotermája (a). A lézersugár kontúrját egy szürke pontozott kör képviseli. A kísérletet kétszer megismételtük (lásd Kiegészítő anyagok, S4 ábra).
A bakteriális sejtek életképességét LA-HTM segítségével több órán keresztül követtük. ábrán. A 3. ábra egy 3 óra 20 perces filmből készült négy kép időintervallumát mutatja (M3 film, kiegészítő információ). Megfigyelték, hogy a baktériumok aktívan szaporodnak a lézer által meghatározott körkörös területen, ahol a hőmérséklet optimális volt, megközelítve a 65 °C-ot. Ezzel szemben a sejtnövekedés jelentősen csökkent, amikor a hőmérséklet 10 másodpercig 50 °C alá esett.
Lézeres melegítés után különböző időpontokban szaporodó G. stearothermophilus baktériumok optikai mélységi képei, (a) t = 0 perc, (b) 1 óra 10 perc, (c) 2 óra 20 perc, (d) 3 óra 20 perc, kívül 200 Kivonat egy egyperces filmből (M3 film, amely a Kiegészítő Információban található), amely a megfelelő hőmérsékleti térképre van felhelyezve. A lézer a \(t=0\) időpontban kapcsol be. Az intenzitású képhez izotermák kerültek.
A sejtnövekedés és a hőmérséklettől való függés további számszerűsítésére a Movie M3 látómezőjében mértük a kezdetben izolált baktériumok különböző telepeinek biomasszájának növekedését (4. ábra). A mini kolóniaképző egység (mCFU) képződésének kezdetén kiválasztott szülőbaktériumok az S6 ábrán láthatók. A száraz tömegméréseket CGM 48 kamerával végeztük, amelyet a hőmérséklet-eloszlás feltérképezésére használtunk. A CGM száraz tömeg és hőmérséklet mérési képessége az LA-HTM erőssége. Ahogy az várható volt, a magas hőmérséklet gyorsabb baktériumszaporodást okozott (4a. ábra). Ahogy a 4b. ábrán látható féllogaritmusú diagramon látható, a növekedés minden hőmérsékleten exponenciális növekedést követ, ahol az adatok a \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ exponenciális függvényt használják {{ \mbox{cst}}}\), ahol \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}2\) – generálási idő (vagy megduplázódási idő), \( g =1/ \tau\) – növekedési ütem (időegységenkénti osztások száma ). ábrán. A 4c. ábra a megfelelő növekedési sebességet és generálási időt mutatja a hőmérséklet függvényében. A gyorsan növekvő mCFU-kat a növekedés két óra elteltével telítettsége jellemzi, ami a magas baktériumsűrűség miatt várható viselkedés (hasonlóan a klasszikus folyékony tenyészetek állófázisához). A \(g\left(T\right)\) általános alak (4c. ábra) megfelel a G. stearothermophilus várható kétfázisú görbéjének, 60-65°C körüli optimális növekedési sebesség mellett. Párosítsa az adatokat egy kardinális modell segítségével (S5 ábra)49 ahol \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, ami jól egyezik a szakirodalomban hivatkozott egyéb értékekkel49. Bár a hőmérsékletfüggő paraméterek reprodukálhatók, a \({G}_{0}\) maximális növekedési sebessége kísérletenként változhat (lásd az S7-S9 ábrákat és az M4 filmet). Ellentétben a hőmérséklet-illesztési paraméterekkel, amelyeknek univerzálisnak kell lenniük, a maximális növekedési sebesség a táptalaj tulajdonságaitól (tápanyagok elérhetősége, oxigénkoncentráció) függ a megfigyelt mikroméretű geometrián belül.
a Mikrobák szaporodása különböző hőmérsékleteken. mCFU: Miniatűr kolóniaképző egységek. Az adatok egy hőmérsékleti gradiensben növekvő egyetlen baktériumról készült videóból (M3 film). b Ugyanaz, mint (a), féllogaritmikus skála. c Lineáris regresszióból (b) számított növekedési ráta\(\tau\) és generálási idő\(g\). Vízszintes hibasávok: hőmérséklet-tartomány, amely felett az mCFU-k a növekedés során a látómezőbe tágultak. Függőleges hibasávok: lineáris regressziós standard hiba.
A normál növekedés mellett néhány baktérium néha a látótérbe került a lézeres melegítés során, ami a flagellákkal fertőzött baktériumok esetében várható viselkedés. A kiegészítő információban található M5 film ilyen úszási tevékenységeket mutat be. Ebben a kísérletben egyenletes lézersugárzást alkalmaztunk hőmérsékleti gradiens létrehozására, amint az 1d, e és S3 ábrákon látható. Az 5. ábra az M5 filmből kiválasztott két képsorozatot mutat be, amelyek azt mutatják, hogy az egyik baktérium irányított mozgást mutat, míg az összes többi baktérium mozdulatlan marad.
A két (a) és (b) időkeret két különböző baktérium úszását mutatja szaggatott körökkel. A képek az M5 filmből származnak (kiegészítő anyagként).
A G. stearothermophilus esetében a baktériumok aktív mozgása (5. ábra) a lézersugár bekapcsolása után néhány másodperccel megindult. Ez a megfigyelés hangsúlyozza ennek a termofil mikroorganizmusnak a hőmérséklet-emelkedésre adott időbeli válaszát, amint azt Mora et al. 24 . A baktériumok motilitása, sőt a termotaxis témaköre tovább tárható az LA-HTM segítségével.
A mikrobiális úszást nem szabad összetéveszteni más típusú fizikai mozgásokkal, nevezetesen (i) a Brown-mozgással, amely meghatározott irány nélküli kaotikus mozgásnak tűnik, (ii) a konvekcióval 50 és a termoforézissel 43, amely a mozgás szabályos eltolódásából áll a hőmérséklet mentén. gradiens.
A G. stearothermophilus arról ismert, hogy rendkívül ellenálló spórákat termel (spóraképződés), ha védekezésként kedvezőtlen környezeti feltételeknek van kitéve. Amikor a környezeti feltételek ismét kedvezővé válnak, a spórák kicsíráznak, élő sejteket képeznek és újraindulnak a növekedés. Bár ez a sporulációs/csírázási folyamat jól ismert, valós időben még soha nem figyelték meg. Az LA-HTM segítségével itt közöljük a G. stearothermophilus csírázási eseményeinek első megfigyelését.
ábrán. A 6a. ábra az optikai mélység (OT) időzített képét mutatja, amelyet 13 spórából álló CGM-készlettel nyertünk. A teljes gyűjtési idő alatt (15 óra 6 perc, \(t=0\) – a lézeres melegítés kezdete) 13 spórából 4 csírázott, egymást követő időpontokban \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' és \(11\) h \(30\)'. Bár ezen események közül csak egy látható a 6. ábrán, az M6 filmben 4 csírázási esemény figyelhető meg a kiegészítő anyagban. Érdekes módon a csírázás véletlenszerűnek tűnik: nem minden spóra csírázik és nem is csírázik egyszerre, a környezeti feltételek azonos változásai ellenére.
8 OT képből (olajimmerziós, 60x, 1,25 NA objektív) és (b) G. stearothermophilus aggregátumok biomassza evolúciójából álló időzített felvétel. c (b) Félig log skálára rajzolva a növekedési sebesség linearitásának kiemelésére (szaggatott vonal).
ábrán. A 6b, c ábra a sejtpopulációk biomasszáját mutatja a látómezőben az idő függvényében az adatgyűjtés teljes időtartama alatt. ábrán \(t=5\)h-nál megfigyelt száraz tömeg gyors bomlása. 6b, c, egyes cellák látómezőből való kilépése miatt. Ennek a négy eseménynek a növekedési üteme \(0,77\pm 0,1\) h-1. Ez az érték magasabb, mint a 3. 3. és 4. ábrához tartozó növekedési sebesség, ahol a sejtek normálisan növekednek. A G. stearothermophilus spórákból való megnövekedett növekedési ütemének oka nem tisztázott, de ezek a mérések rávilágítanak az LA-HTM érdeklődésére, és az egysejtszinten (vagy egyetlen mCFU-szinten) dolgoznak, hogy többet megtudjanak a sejtélet dinamikájáról .
Az LA-HTM sokoldalúságának és magas hőmérsékleten való teljesítményének további bizonyítása érdekében megvizsgáltuk a Sulfolobus shibatae, egy hipertermofil acidofil archaea növekedését, amelynek optimális növekedési hőmérséklete 80 °C51. A G. stearothermophilushoz képest ezeknek az archaeáknak is nagyon eltérő a morfológiája, inkább 1 mikronos gömbökre (coccusokra) hasonlítanak, semmint megnyúlt pálcikákra (bacilusokra).
A 7a. ábra a S. shibatae mCFU szekvenciális optikai mélységképeiből áll, amelyeket CGM-mel kaptunk (lásd az M7 játékfilmet a Kiegészítő anyagokban). Ez az mCFU körülbelül 73 °C-on nő, az optimális 80 °C-os hőmérséklet alatt, de az aktív növekedés hőmérsékleti tartományán belül. Számos olyan hasadási eseményt figyeltünk meg, amelyek néhány óra elteltével az mCFU-k archaea mikroszőlőjének tűntek. Ezekből az OT képekből az mCFU biomasszát idővel mértük, és a 7b. ábrán mutattuk be. Érdekes módon a S. shibatae mCFU-k lineáris növekedést mutattak, nem pedig a G. stearothermophilus mCFU-knál tapasztalt exponenciális növekedést. Régóta vita 52 folyik a sejtnövekedési sebesség természetéről: míg egyes tanulmányok a mikrobák méretével arányos növekedési ütemről számolnak be (exponenciális növekedés), mások állandó sebességet mutatnak (lineáris vagy bilineáris növekedés). Amint azt Tzur et al.53 kifejti, az exponenciális és a (bi)lineáris növekedés megkülönböztetése <6%-os pontosságot igényel a biomassza méréseknél, ami a legtöbb QPM technikánál elérhetetlen, még az interferometriát is beleértve. Amint azt Tzur et al.53 kifejti, az exponenciális és a (bi)lineáris növekedés megkülönböztetése <6%-os pontosságot igényel a biomassza méréseknél, ami a legtöbb QPM technikánál elérhetetlen, még az interferometriát is beleértve. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точорености <6% изморености ижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Amint azt Zur et al.53 kifejti, az exponenciális és a (bi)lineáris növekedés megkülönböztetése <6%-os pontosságot igényel a biomassza méréseknél, ami a legtöbb QPM módszernél még interferometria használatával sem érhető el.Amint azt Zur et al. 53, az exponenciális és a (bi)lineáris növekedés megkülönböztetése kevesebb, mint 6%-os pontosságot igényel a biomassza méréseknél, ami a legtöbb QPM módszernél még interferometria használata esetén sem érhető el. A CGM ezt a pontosságot pg alatti pontossággal éri el a biomassza méréseknél36,48.
a Time-lapse 6 OT képből (olajimmerziós, 60x, NA objektív 1,25) és (b) mikro-CFU biomassza evolúcióból, CGM-mel mérve. További információért lásd az M7 filmet.
A S. shibatae tökéletesen lineáris növekedése váratlan volt, és még nem számoltak be róla. Mindazonáltal exponenciális növekedés várható, legalábbis azért, mert idővel 2, 4, 8, 16 … sejtből álló többszörös osztódásnak kell bekövetkeznie. Feltételeztük, hogy a lineáris növekedés oka lehet a sűrű sejttömörödés miatti sejtgátlás, ahogyan a sejtnövekedés is lelassul, és végül alvó állapotba kerül, ha túl magas a sejtsűrűség.
Befejezésül a következő öt érdekességet sorban megvitatjuk: a fűtési térfogat csökkentése, a termikus tehetetlenség csökkentése, az arany nanorészecskék iránti érdeklődés, a kvantitatív fázismikroszkópia iránti érdeklődés és egy lehetséges hőmérséklet-tartomány, amelyben az LA-HTM használható.
Az ellenállásos fűtéshez képest a HTM fejlesztéshez használt lézerfűtés több előnnyel is jár, amelyeket jelen tanulmányban szemléltetünk. Különösen a mikroszkóp látóterében lévő folyékony közegben a melegítési térfogat néhány (10 μm) 3 térfogaton belül marad. Ily módon csak a megfigyelt mikrobák aktívak, míg a többi baktérium alvó állapotban van, és felhasználható a minta további vizsgálatára – nem kell minden alkalommal cserélni a mintát, amikor új hőmérsékletet kell ellenőrizni. Ezen túlmenően a mikroméretű melegítés nagy hőmérséklet-tartomány közvetlen vizsgálatát teszi lehetővé: a 4c. ábra egy 3 órás filmből (M3 film) készült, amely általában több minta előkészítését és vizsgálatát igényli – minden vizsgált mintához egyet. y a hőmérséklet, amely a kísérlet napjainak számát jelenti. A fűtött térfogat csökkentése a mikroszkóp összes körülvevő optikai alkatrészét, különösen az objektívlencsét is szobahőmérsékleten tartja, ami eddig a közösség legnagyobb problémája volt. Az LA-HTM bármilyen objektívvel használható, beleértve az olajmerítési lencséket is, és szobahőmérsékleten marad még szélsőséges látómező mellett is. A lézeres fűtési módszer fő korlátja, amelyről ebben a tanulmányban beszámolunk, az, hogy azok a sejtek, amelyek nem tapadnak vagy lebegnek, távol lehetnek a látómezőtől, és nehezen tanulmányozhatók. Megoldás lehet az alacsony nagyítású lencsék használata, amellyel nagyobb, néhány száz mikronnál nagyobb hőmérséklet-emelkedés érhető el. Ez az óvatosság a térbeli felbontás csökkenésével jár, de ha a mikroorganizmusok mozgásának vizsgálata a cél, akkor nincs szükség nagy térbeli felbontásra.
A rendszer fűtésének (és hűtésének) időskálája \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) a méretétől függ, törvény szerint \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), ahol \ (L\ ) a hőforrás jellemző mérete (a lézersugár átmérője vizsgálatunkban \(L\ kb. 100\) μm), \(D\) a környezet hődiffúzivitása (a mi átlagunkban). tok, üveg és víz Diffúziós sebesség\(D\ kb. 2\-szeres {10}^{-7}\) m2/s). hőmérséklet-változásokra lehet számítani. Ez a pillanatnyi hőmérséklet-emelkedés nem csak lerövidíti a kísérlet időtartamát, hanem lehetővé teszi a pontos időzítést \(t=0\) a hőmérsékleti hatások bármilyen dinamikus vizsgálatához.
Javasolt módszerünk bármilyen fényelnyelő hordozóra alkalmazható (például ITO bevonattal ellátott kereskedelmi minták). Az arany nanorészecskék azonban képesek nagy abszorpciót biztosítani az infravörösben és alacsony abszorpciót a látható tartományban, amelyek utóbbi jellemzői a látható tartományban a hatékony optikai megfigyelés szempontjából érdekesek, különösen fluoreszcencia alkalmazásakor. Ezenkívül az arany biokompatibilis, kémiailag inert, az optikai sűrűség 530 nm-től közeli infravörösig állítható, a minta előkészítése pedig egyszerű és gazdaságos29.
A keresztirányú rácsos hullámfront-mikroszkóp (CGM) nemcsak hőmérséklet-térképezést tesz lehetővé mikroskálán, hanem a biomassza monitorozását is, így különösen hasznos (ha nem szükséges) az LA-HTM-mel kombinálva. Az elmúlt évtizedben más hőmérséklet-mikroszkópos technikákat fejlesztettek ki, különösen a bioképalkotás területén, és ezek többsége hőmérséklet-érzékeny fluoreszcens szondák használatát igényli54,55. Azonban ezeket a módszereket kritizálták, és egyes jelentések irreális hőmérséklet-változásokat mértek a sejteken belül, valószínűleg annak a ténynek köszönhető, hogy a fluoreszcencia a hőmérsékleten kívül sok más tényezőtől is függ. Ezenkívül a legtöbb fluoreszcens szonda instabil magas hőmérsékleten. Ezért a QPM és különösen a CGM ideális hőmérséklet-mikroszkópos technikát jelent a magas hőmérsékleten való élet optikai mikroszkópos vizsgálatához.
A 80°C-on optimálisan élő S. shibatae vizsgálatai azt mutatják, hogy az LA-HTM nem csak egyszerű termofilek, hanem hipertermofilek vizsgálatára is alkalmazható. Elvileg nincs korlátozva az LA-HTM használatával elérhető hőmérséklet-tartomány, és még 100°C feletti hőmérséklet is elérhető légköri nyomáson forralás nélkül, amint azt a 38 fős csoportunk bebizonyította a hidrotermikus kémiai alkalmazásokban légköri hőmérsékleten. nyomás A. Az arany nanorészecskék 40 melegítésére ugyanúgy lézert használnak. Így az LA-HTM alkalmas arra, hogy példátlan hipertermofilek megfigyelésére szabványos nagy felbontású optikai mikroszkóppal standard körülmények között (azaz környezeti igénybevétel mellett).
Minden kísérlet házi készítésű mikroszkóppal történt, beleértve Köhler megvilágítást (LED-vel, M625L3, Thorlabs, 700 mW), mintatartót kézi xy mozgással, objektíveket (Olympus, 60x, 0,7 NA, levegő, LUCPlanFLN60X vagy 60x, NA, 1,25). , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI keresztrács, 39 µm-es osztás, 0,87 mm a Zyla Andor kameraérzékelőtől) az intenzitás és a hullámfront képalkotáshoz, valamint az sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16 bites mód, a Hamamatsutól) a felvétel rögzítéséhez az 5. ábrán látható adatok (bakteriális úszás). A dikroikus nyalábosztó egy 749 nm-es BrightLine él (Semrock, FF749-SDi01). A kamera előlapján található szűrő egy 694-es rövid áteresztő szűrő (FF02-694/SP-25, Semrock). Titán zafír lézer (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpált cunami lézer üreg, Spectra-Physics a 2-5. ábrán, tovább helyettesítve Millenia lézerrel, Spectraphysics 10 W, pumpált Mira lézer üreg, Koherens, a 2. ábrához -5). 6. és 7.) \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm hullámhosszra van beállítva, ami megfelel az arany nanorészecskék plazmonrezonancia spektrumának. Térbeli fénymodulátorok (1920 × 1152 pixel) a Meadowlark Optics-tól vásároltuk.
A keresztrácsos hullámfrontmikroszkóp (CGM) egy optikai mikroszkópos technika, amely egy kétdimenziós diffrakciós rács (más néven keresztrács) kombinálásán alapul, egy milliméteres távolságra a hagyományos kamera érzékelőjétől. A CGM leggyakoribb példája, amelyet ebben a tanulmányban használtunk, négyhullámhosszú keresztirányú eltolódású interferométernek (QLSI) nevezik, ahol a keresztrács egy intenzitás/fázis sakktábla mintázatból áll, amelyet Primot és munkatársai vezettek be és szabadalmaztattak. 2000-ben34. A függőleges és vízszintes rácsvonalak rácsszerű árnyékokat hoznak létre az érzékelőn, amelyek torzítása valós időben numerikusan feldolgozható a beeső fény optikai hullámfront-torzításának (vagy azzal egyenértékű fázisprofiljának) eléréséhez. Mikroszkópon használva a CGM kamera nanométeres nagyságrendű érzékenységgel képes megjeleníteni egy leképezett objektum optikai útkülönbségét, más néven optikai mélységet (OT). Bármely CGM-mérésnél az optikai komponensek vagy nyalábok hibáinak kiküszöbölése érdekében egy elsődleges referencia OT-képet kell készíteni, és ki kell vonni a későbbi képekből.
A hőmérséklet-mikroszkópos vizsgálatot CGM-kamerával végeztük a hivatkozásban leírtak szerint. 32. Röviden, a folyadék felmelegítése megváltoztatja a törésmutatóját, termikus lencsehatást hozva létre, amely torzítja a beeső sugarat. Ezt a hullámfront-torzulást a CGM méri, és egy dekonvolúciós algoritmus segítségével dolgozza fel, hogy háromdimenziós hőmérséklet-eloszlást kapjunk a folyékony közegben. Ha az arany nanorészecskék egyenletesen oszlanak el a mintában, akkor a baktériumoktól mentes területeken hőmérséklet-leképezést lehet végezni, hogy jobb képeket készítsünk, amit néha meg is teszünk. A referencia CGM-képet fűtés nélkül (kikapcsolt lézer mellett) vettük fel, majd a kép ugyanazon a pontján rögzítettük, bekapcsolt lézerrel.
A száraz tömegmérés ugyanazzal a CGM kamerával történik, amelyet a hőmérsékleti képalkotáshoz használnak. A CGM referenciaképeket úgy kaptuk, hogy a mintát gyorsan x és y irányba mozgattuk az expozíció során, hogy átlagoljuk az OT baktériumok jelenléte miatti inhomogenitását. A baktériumokról készült OT-képekből a biomasszát a Matlab házilag készített szegmentációs algoritmusával kiválasztott területeken található képek együttesével határozták meg (lásd a „Numerikus kód” alfejezetet), a ref. 48. Röviden, a \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} relációt használjuk } x{{\mbox{d}}}y\), ahol \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) az optikai mélységű kép, \(m\) a száraz tömeg és a \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) egy állandó. A \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg értéket választottuk, ami az élő sejtek tipikus állandója.
Egy 25 mm átmérőjű és 150 µm vastagságú, arany nanorészecskékkel bevont fedőlemezt helyeztünk egy AttofluorTM kamrába (Thermofisher) úgy, hogy az arany nanorészecskék felfelé nézzenek. A Geobacillus stearothermophilust egy éjszakán át előtenyésztettük LB tápközegben (200 ford./perc, 60 °C) minden kísérleti nap előtt. Egy csepp 5 µl G. stearothermophilus 0,3-0,5 optikai sűrűségű (OD) szuszpenzióját arany nanorészecskéket tartalmazó fedőlemezre helyeztük. Ezután egy 18 mm átmérőjű kerek fedőlemezt 5 mm átmérőjű lyukkal a közepén csepegtettünk a cseppre, és ismételten 5 μl azonos optikai sűrűségű baktériumszuszpenziót vittünk a lyuk közepére. A fedőlemezeken lévő lyukakat a ref. 45 (további információért lásd a Kiegészítő információkat). Ezután adjon hozzá 1 ml LB táptalajt a fedőlemezhez, hogy megakadályozza a folyadékréteg kiszáradását. Az utolsó fedőlemezt az Attofluor™ kamra zárt fedelére helyezzük, hogy megakadályozzuk a táptalaj elpárolgását az inkubálás során. A csírázási kísérletekhez spórákat használtunk, amelyek a hagyományos kísérletek után esetenként befedték a felső fedőlemezt. Hasonló módszert alkalmaztak a Sulfolobus shibatae előállításához. Három napig (200 ford./perc, 75 °C) a Thiobacillus serrata előtenyésztését hajtottuk végre a 182. táptalajban (DSMZ).
Az arany nanorészecskék mintáit micellás blokk-kopolimer litográfiával állítottuk elő. Ezt a folyamatot a Fejezetben ismertetjük részletesen. 60. Röviden, aranyionokat kapszulázó micellákat szintetizáltunk a kopolimer és HAuCl4 toluolban való összekeverésével. A megtisztított fedőlemezeket ezután az oldatba merítettük, és UV-sugárzással kezeltük redukálószer jelenlétében, így aranymagokat kaptunk. Végül az aranymagokat úgy növesztettük, hogy egy fedőlemezt KAuCl4 és etanol-amin vizes oldatával 16 percig érintkezésbe hoztunk, ami a közeli infravörös nem gömb alakú arany nanorészecskék kváziperiodikus és nagyon egyenletes elrendezését eredményezte.
Az interferogramok OT-képekké alakításához házilag készített algoritmust használtunk, a linkben részletezettek szerint. 33, és Matlab-csomagként érhető el a következő nyilvános tárolóban: https://github.com/baffou/CGMprocess. A csomag képes kiszámítani az intenzitást és az OT képeket a rögzített interferogramok (beleértve a referenciaképeket is) és a kameratömb távolsága alapján.
Az SLM-re alkalmazott fázismintázat kiszámításához egy adott hőmérsékleti profil eléréséhez egy korábban kifejlesztett házi algoritmust39,42 használtunk, amely elérhető a következő nyilvános adattárban: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. A bemenet a kívánt hőmérsékletmező, amely digitálisan vagy monokróm bmp képen keresztül állítható be.
A sejtek szegmentálásához és száraz tömegük méréséhez a következő nyilvános adattárban közzétett Matlab algoritmusunkat használtuk: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. A felhasználónak minden egyes képen rá kell kattintania a kívánt baktériumra vagy mCFU-ra, be kell állítania a pálca érzékenységét, és meg kell erősítenie a választást.
A tanulmány tervezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg a természetkutatási jelentés absztraktot, amely ehhez a cikkhez kapcsolódik.
A tanulmány eredményeit alátámasztó adatok ésszerű kérésre rendelkezésre állnak a megfelelő szerzőktől.
A tanulmányban használt forráskódot a Methods szakasz részletezi, a hibakeresési verziók pedig letölthetők a https://github.com/baffou/ oldalról a következő tárolókban: SLM_temperatureShaping, CGMprocess és CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Betekintés a termofilekbe és széles spektrumú alkalmazásaikba. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Betekintés a termofilekbe és széles spektrumú alkalmazásaikba.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. és Sharma, AK A termofilek áttekintése és széleskörű alkalmazása. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. és Sharma AK A termofilek mélyreható ismerete és az alkalmazások széles köre.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Feladás időpontja: 2022-09-26